依达拉奉通过抗炎、抗氧化对大鼠缺氧性肺动脉高压病理发展的抑制作用

金海峰 王月飞 郭林娜 姜杨 李雪梅 刘吉成 周忠光 洪炳哲

(齐齐哈尔医学院 1解剖教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161000；2医药科学研究院；3 生理教研室；4 临床教学中心；5 黑龙江中医药大学中西医结合基础医学院；6 齐齐哈尔医学院附属第三医院心内科)

肺动脉高压是一种进行性闭塞性肺血管病变，其病因多样，病死率极高〔1〕。根据世界卫生组织(WHO)的分类，肺动脉高压分为5个亚型，其中缺氧性肺动脉高压(HPH)属于第3亚型，主要由支气管肺发育不良、肺泡低通气障碍、慢性阻塞性肺疾病、肺间质性疾病或长期处于高海拔地区而导致的肺泡长期处于缺氧状态而引起的，是一种老年人多发的慢性疾病〔2,3〕。因目前临床上尚缺乏有效治疗药物，HPH又称之为心血管系统中的“癌症”，如何有效防治HPH已成为目前急需解决的一项重大难题。依达拉奉作为一种强效自由基清除剂，可通过抑制脂质过氧化反应，从而抑制脑细胞、神经细胞的氧化损伤，现已成为临床治疗急性脑梗死的常规药物。本研究通过建立HPH大鼠模型，并给予依达拉奉进行干预，探讨其对HPH病理发展的可能作用及其相关机制。

1 材料和方法

1.1药物与试剂 依达拉奉(批号：BCBR2606V)，购自美国Sigma-Aldrich公司。丙二醛(MDA)检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。IL-1β抗体、TNF-α抗体、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体、GAPDH抗体均购自Santa Cruz Biotechnology。

1.2实验动物与分组 21只雄性SD大鼠(180～200g)购自齐齐哈尔医学院实验动物中心〔实验动物合格证号：SCXK(黑)2016-001-001〕。将大鼠随机分为对照组、HPH组、依达拉奉组各7只。HPH组和依达拉奉组大鼠置于低氧箱中，低氧时间为18 h/d，持续28 d，低氧箱中O2浓度为10%。依达拉奉以5 mg/(kg·d)的用量，对大鼠进行腹腔注射；HPH组腹腔注射同等体积生理盐水。实验动物于低氧处理1 w前开始给药直至实验结束。低氧箱中大鼠呼出的CO2及水蒸气，利用碱石灰及无水氯化钙进行吸收。

1.3血流动力学及右心室肥厚指标检测 实验结束后，大鼠进行腹腔注射麻醉，将充满肝素的PE导管经大鼠右侧颈静脉插入到右心室，利用BL-420S生物信号采集与分析系统，监测大鼠的右心室收缩压力(RVSP)，用于判定大鼠肺动脉压力变化。之后游离出大鼠心脏，去除心房，将心室分成右心室(RV)和左心室+室间隔(LV+S)，分别称重并计算出比值RV/(LV+S)，用于判定右心室肥厚程度。

1.4肺组织苏木素-伊红(HE)染色 将肺组织剪成3 mm3大小的组织块，利用4%多聚甲醛进行固定、梯度酒精脱水，并进行透明、浸蜡、包埋等操作，再将组织块切成4 μm厚的切片，进行HE染色。选取直径在50～200 μm之间的肺动脉，利用Image Pro Plus6.0图像分析系统进行观察并测量所选肺动脉的血管总面积、中膜面积、外径及内径。利用下列公式判定肺动脉增厚程度：肺动脉厚度百分比(WT%)=(外径-内径)/外径×100%；肺动脉面积百分比(WA%)=中膜面积/血管面积×100%。

1.5肺组织免疫组化染色 将肺组织石蜡切片进行脱蜡、复水、抗原修复、3%H2O2阻断内源性过氧化物酶、5%山羊血清封闭后，进行α-SMA的免疫组化染色，并利用Image Pro Plus图像分析系统对所选肺动脉进行α-SMA光密度值(OD值)测定。

1.6MDA、IL-1β、TNF-α含量检测 通过大鼠颈外动脉抽取动脉血离心并提取血清，利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒检测血清中的MDA、IL-1β、TNF-α含量。将肺组织制作成匀浆、离心并提取上清液，检测肺组织中的MDA含量。

1.7肺组织IL-1β和TNF-α蛋白检测 提取肺组织总蛋白，利用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白浓度。等量蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，经5%牛奶封闭，一抗、二抗孵育后，利用ECL发光试剂盒，检测大鼠肺组织中IL-1β和TNF-α蛋白表达变化。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1依达拉奉抑制了肺动脉压力的升高及右心室的肥厚 HPH组RVSP和RV/(LV+S)较对照组显著升高(P<0.01)；依达拉奉组RVSP、RV/(LV+S)较HPH组显著降低(P<0.01)，见图1，表1。

2.2依达拉奉抑制了肺动脉结构重建 肺组织HE染色结果显示，与对照组相比，HPH组WT%和WA%显著升高(P<0.01)，肺动脉管壁明显增厚、管腔明显狭小，表明肺动脉结构重建明显，依达拉奉组肺动脉结构重建受到有效抑制(P<0.01)，见表1，图2。

2.3依达拉奉抑制了肺动脉α-SMA的高表达 对肺组织进行的平滑肌标志性蛋白α-SMA免疫组化染色结果显示，HPH组肺动脉α-SMA的OD值较对照组显著升高(P<0.01)，证明由低氧诱导的肺动脉结构重建，主要是因为肺动脉中层平滑肌细胞的过度增生而导致。而依达拉奉组肺动脉α-SMA OD值较HPH组显著降低(P<0.01)，见表1，图3。

2.4依达拉奉降低了血清及肺组织中的MDA含量 与对照组相比，HPH组血清及肺组织中MDA含量显著升高(P<0.01)；达拉奉组血清及肺组织中MDA含量较HPH组显著降低(P<0.01)，提示依达拉奉显著降低了低氧诱导的HPH大鼠体内的氧化损伤，见表2。

2.5依达拉奉降低了大鼠体内炎症因子的高表达 HPH组血清中的炎症因子IL-1β和TNF-α含量及肺组织中的IL-1β和TNF-α蛋白表达量较对照组显著升高(P<0.01)；而依达拉奉组血清中IL-1β、TNF-α含量及肺组织中IL-1β、TNF-α蛋白表达量较HPH组显著降低(P<0.01)，见表2，图4。

图1 各组大鼠RVSP

表1 各组RVSP、RV/(LV+S)、肺动脉WT%值、WA%值、α-SMA的OD值

图2 各组肺组织HE染色(×400)

图3 各组肺组织α-SMA免疫组化染色(×400)

表2 各组血清及肺组织中的MDA含量及血清中IL-1β、TNF-α含量比较

图4 Western印迹检测各组IL-1β和TNF-α蛋白表达

3 讨 论

HPH病理发展特点为长期低氧导致的肺动脉内皮细胞功能失调及肺动脉中层平滑肌细胞的过度增生性改变，从而引起肺动脉结构重建、管腔逐渐闭塞、动脉阻力增加、顺应性降低，随着病情进一步发展及肺动脉压力的持续性升高，最终将导致右心室衰竭〔1,4〕。目前的药理学治疗侧重于利用血管舒张药物以缓解症状，但对血管重建的影响有限，并且长期应用甚至会加重HPH患者的缺氧状态〔5〕。作为一种强效抗氧化剂，依达拉奉最早于2001年在日本被批准用于急性脑梗死患者的常规治疗药物，并于2015年进一步被用于肌萎缩侧索硬化的治疗〔6,7〕。近年，除神经系统外，依达拉奉在心血管系统相关疾病中的治疗作用已得到广泛研究。诸多实验研究已证明，依达拉奉可通过抗氧化、抗感染、抗凋亡等机制，对动脉粥样硬化、高血压、心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死及扩张性心肌病等具有良好的保护及治疗作用〔8,9〕。虽然，依达拉奉目前已被证明具有抗氧化、抗感染及治疗心血管诸多疾病的作用，但是在HPH病理发展中的可能作用目前还没有相关的文献报道。本研究结果提示，依达拉奉能够明显抑制低氧诱导的大鼠肺动脉压力的升高及右心室的肥厚，并通过抑制肺动脉中层平滑肌细胞的过度增生，从而有效缓解肺动脉的结构重建。

在HPH的病理发展过程中，由低氧诱导的活性氧的过量产生起着至关重要的作用。在低氧条件下，肺组织细胞中的NADPH氧化酶系统及线粒体等会产生大量过氧化氢、超氧化物阴离子等活性氧物质，从而导致肺组织的氧化应激损伤〔10〕。活性氧不仅损伤肺动脉内皮细胞使其丧失肺动脉与血液之间的屏障功能，还可作为信号传递中的第二信使激活其下游一系列与细胞增殖相关的信号通路，从而促进肺动脉平滑肌细胞的过度增生〔11〕。大量研究表明，敲除小鼠体内的NADPH氧化酶亚型Nox4或Nox2或给予大鼠抗氧化酶药物，均能够有效抑制小鼠和大鼠HPH的发生与发展〔11～13〕。因此，抑制低氧诱导的氧化应激损伤，是防治HPH病理发展的有效方法之一。MDA是脂质过氧化的标志性产物，其含量的变化代表着生物体内氧化应激损伤的程度。本研究发现，依达拉奉能够明显降低HPH模型大鼠肺组织及血清中的MDA高表达，提示依达拉奉在HPH病理发展过程中对低氧诱导的氧化应激损伤具有良好的抑制作用。

另外，由低氧诱导的炎症反应是促进HPH的病理发展的另一重要因素。将实验动物暴露于慢性低氧环境下，会引起大量炎症细胞及炎症因子在肺部聚集，并进一步破坏肺动脉内皮细胞的完整性及促进肺动脉壁中层平滑肌细胞的过度增生，从而导致肺动脉的结构重建〔14〕。炎症因子中IL-1β和TNF-α在几乎全部肺动脉高压患者的血清中均增高，并且临床上将IL-1β和TNF-α的表达变化作为患者疾病发展的严重程度及预后的重要指标〔15〕。抑制动物体内的IL-1β和TNF-α高表达，能够有效改善低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞的过度增生及肺动脉结构重建，从而抑制HPH的病理发展〔16〕。本研究结果提示，在大鼠HPH病理发展过程中，依达拉奉能够有效抑制炎症因子IL-1β和TNF-α的高表达。

综上，依达拉奉作为一种强效抗氧化剂，不仅通过抑制大鼠体内低氧诱导的氧化应激损伤，并通过抑制炎症反应，改善HPH大鼠肺动脉平滑肌细胞的过度增生、肺动脉结构重建、肺动脉压力的升高及右心室的肥厚，从而抑制HPH的病理发展。