丹贝益肺汤对博来霉素诱导肺纤维化大鼠肺纤维化及肺血管重塑的影响

李 强，杨雅婷，程 娜，金冠男，杜松毫，张碧海，江柏华，蔡萧君

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

特发性肺纤维化(Idopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种常见的肺部弥漫性炎症疾病，以渐进性劳力性气促、限制性通气功能障碍为主要表现，具有病程进展快、肺功能进行性下降、严重可因呼吸衰竭而死亡的特点，是间质性肺炎(usual interstitial pneumonia，UIP)最常见、最严重的临床亚型[1]。目前，尼达尼布、吡非尼酮及部分中药方剂应用于临床轻、中度IPF的治疗[2]，而肺移植仍是特发性肺纤维化患者疾病后期的最终选项；但由于供体有限及其在手术水平及移植后器官维持治疗等方面依旧面临巨大挑战[3-4]，迫切需要明确特发性肺纤维化的形成机制，开发治疗IPF相关药物成为临床及实验研究热点。多项研究显示，调节血管内皮细胞功能紊乱是有效控制IPF血管重塑、改善低氧的理想手段[5]。

丹贝益肺汤是江柏华教授依据多年临床经验总结出的治疗肺纤维化的有效方剂。本实验通过构建BLM诱导肺纤维化大鼠模型，观察丹贝益肺汤对肺纤维化肺组织病理变化及血清eNOS、ET-1及vWF因子水平的影响，探讨丹贝益肺汤对特发性肺纤维化及肺血管重塑的作用，为该方药临床治疗IPF提供实验室依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康SPF级5周龄雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，购于哈尔滨医科大学实验动物学部，合格证号:SCXK(黑)2019-001，在湿度40%～65%、温度20～26 ℃、清洁级动物房内，适应性饲养1周。动物实验过程符合3R原则。

1.2 实验药物 丹贝益肺汤(丹参、平贝、党参、黄芪、补骨脂、五味子、川芎、桃仁、地龙、麦冬、桔梗)中药饮片购自黑龙江省药材公司，中药浸膏制备委托黑龙江省祖研北药科技开发有限责任公司加工成为干浸膏,于冰箱4 ℃保存备用。临用时制备成生药浓度为0.38 g/mL水溶液。甲泼尼龙片(MT)：天津天药药业股份有限公司，批准文号：国药准字H20020224。

1.3 实验试剂 注射用盐酸博来霉素：瀚晖制药有限公司；HE染液、Masson 染液：南京建成科技有限公司；大鼠eNOS、ET-1、vWFELISA检测试剂盒：杭州联科生物技术有限公司。

1.4 实验仪器 KW-WH大鼠雾化给药仪：南京卡尔文生物科技有限公司；3K15低温高速离心机：Sigma公司；3K15显微低温高速离心机：Sigma公司； BX51-cell Sens Entry显微照相系统：Olympus公司；MULTISKAN GO酶标仪：Thermo公司；OmegaLum G化学发光凝胶成像系统：Aple-gen公司。

2 实验方法

2.1 动物造模与分组给药 120 只SD大鼠采用随机数字表法分为正常对照组、模型组、阳性对照组和丹贝益肺汤高、中、低剂量组，每组20只。除正常组外，其余各组大鼠各组用BLM稀释液(60 g/L)进行雾化吸入造模[6]，每次30 min，每天1 次，连续雾化吸入7 d；正常对照组雾化吸入等量生理盐水。成模后模型组给予生理盐水(15 mL/kg)；阳性组给予MT混悬液(4.2 mg/kg)；高、中、低剂量组分别给予丹贝益肺中药液15.2、7.6、3.8 g/kg灌胃,每天1 次，连续灌胃28 d。灌胃给药期间，模型组死亡3 只，阳性组和丹贝低、中、高剂量组均死亡2 只。

2.2 观察指标

2.2.1 血清eNOS、ET-1、vWF测定 末次给药后禁食不禁水12 h，腹主动脉采血，离心取血清，ELISA检测各组大鼠血清eNOS、ET-1及vWF。

2.2.2 病理观察 采血后，处死大鼠，取肺组织，4%多聚甲醛溶液中固定，横切，间隔3 mm，4%多聚甲醛溶液中固定72 h，不同梯度酒精脱水，4 ℃二甲苯溶液透明，浸蜡，55℃恒温4 h，包埋，5μm切片，分别行HE染色、Masson染色，光镜观察。

3 结果

3.1 各组大鼠血清eNOS、ET-1、vWF测定结果比较 见表1。

表1 各组大鼠血清eNOS、ET-1、vWF水平比较

3.2 各组大鼠病理学观察结果

3.2.1 HE染色结果 正常对照组大鼠肺组织结构完整，没有明显形态学变化,未见病理变化。模型组大鼠肺泡结构不完整，肺泡间隙明显变宽，肺泡结构部分紊乱、塌陷，同时伴有炎性细胞浸润,以及纤维细胞及纤维组织增生。甲泼尼龙组病情较正常肺组织肺泡间隙明显变宽，肺泡结构存在部分紊乱、塌陷，存在少许炎性细胞浸润,以及部分成纤维细胞及纤维组织增生。丹贝高、中、低剂量组大鼠病理改变较模型组明显减轻，丹贝高剂量组病理改变与甲泼尼龙组相近。见图1。

图1 各组大鼠肺组织HE染色结果(×100)

3.2.2 Masson染色结果 正常对照组肺组织结构完整，支气管壁未见明显增厚，胶原层较为薄弱，部分肺泡区出现少量浅蓝色的胶原纤维。模型组多数支气管、血管以及肺泡隔厚度增加，可见大量蓝色胶原纤维，肺泡结构显示不完整。甲泼尼龙组、丹贝益肺高剂量组、中剂量组、低剂量组肺纤维化程度相对较轻，肺间质及其周围的支气管、血管、肺泡等区域，胶原蓝染部分减少；其中，丹贝益肺高剂量组胶原蓝染区域与甲泼尼龙组相近。

图2 各组大鼠肺组织Masson 染色结果(×100)

4 讨论

肺间质纤维化是由炎症引起的一种慢性疾病，长期的慢性炎症可引起肺的血管重塑，疾病加重，临床治疗方法有限[7]。在肺纤维化发生发展中，血管内皮细胞功能失调如ET-1表达增加，引起新生血管异常生成，导致血管重塑的积累，病情进展[8]。

肺间质纤维化属中医“肺痿”范畴，江柏华教授认为IPF的病因为先天禀赋不足、久病失养等引起肺气亏虚,抗邪无力,外邪反复袭肺，导致肺失宣肃,痰瘀阻肺,久病累及脾、肾，致脾肾亏虚。气虚血瘀、痰浊内阻为IPF的核心病机,并贯穿疾病始终。因此,治疗IPF应以益气破瘀化浊,虚实兼治。丹贝益肺汤由丹参、平贝、党参、黄芪、补骨脂、五味子、川芎、桃仁、地龙、麦冬、桔梗组成。方中丹参味苦，寒，能够活血止痛凉血，同时有安神除烦的效用，性缓，祛瘀生新不伤正；平贝化痰止咳，滋阴定喘，肺纤维化阴伤肺痿，平贝正宜；丹参、平贝辛开苦降，活血化瘀，祛痰通络，共为君药；党参、黄芪、补骨脂健脾益气，补益正气，正气足防止外邪侵扰，对于身体虚弱的长期慢性病患者尤其重要，而补骨脂可以纳气平喘；五味子益气生津，敛肺补肾；川芎、地龙、桃仁活血通络；麦冬滋养肺胃之阴。诸药配伍得当，升降有度，益气活血不伤阴，补益肺肾。

肺组织纤维化大鼠血管内皮细胞合成eNOS的功能明显下降，促进肺纤维化的发展[9]，本实验选取eNOS作为评价内皮细胞功能和肺纤维化程度的指标。结果发现，中高剂量丹贝益肺汤干预后的肺纤维化大鼠血清eNOS水平明显升高。在肺纤维化区域，由于毛细血管减少，反馈性调节促使促血管生成因子如ET-1表达增高，新血管生成并增生肥厚，导致血管重塑，同时随着疾病进展，血管内皮细胞损伤，标志性因子vWF表达增加[5]。因此，ET-1和vWF两者均可作为评估肺纤维化血管内皮细胞损伤指标。本研究中，博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型血清ET-1和vWF水平明显增高，丹贝益肺汤干预后，二者明显下降，尤其是中高剂量组。表明丹贝益肺汤可减轻肺纤维化血管内皮细胞损伤，且呈剂量依赖性。

有研究显示慢性炎症的反复刺激可促进肺纤维化血管重塑的发展[10]。本研究在博来霉素诱导的肺纤维化模型中通过HE染色发现，肺组织及气道周围炎症细胞浸润明显增多，同时Masson染色发现在炎症明显增多的部位，胶原纤维明显沉积，肺泡腔明显扩大，肺泡壁增厚，肺组织纤维化程度加重。丹贝益肺汤干预后，炎症细胞数量减少，胶原沉积减轻，尤其是中高剂量组。提示丹贝益肺汤具有减轻肺间质纤维化大鼠肺组织炎症和胶原沉积租用，抑制肺组织血管重构。

综上，丹贝益肺汤可剂量依赖性减轻博来霉素诱导的大鼠肺纤维化，抑制肺血管重塑，其他作用机制尚待进一步探讨。