基于网络药理学研究香砂六君子汤治疗功能性消化不良的作用机制

罗晶心 王 威

基于网络药理学研究香砂六君子汤治疗功能性消化不良的作用机制

罗晶心1,2王 威1,2

（1.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193；2.国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300193）

目的：基于网络药理学研究香砂六君子汤治疗功能性消化不良的作用机制。方法：通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）筛选出香砂六君子汤成分中口服生物利用度（OB）≥20%，药物相似度（DL）≥0.10的化合物作为药物有效成分，并获取其蛋白靶点信息，通过Gene Cards数据库筛选功能性消化不良靶点基因，利用Venny 2.1得到药物与疾病交集基因，利用Cytoscape 3.9.1构建“有效成分-靶点”网络及“药物-疾病-靶点”网络，使用String 11.5数据库构建PPI网络，并利用Matescape网站进行KEGG通路富集分析及GO功能富集分析。结果：香砂六君子汤治疗功能性消化不良的有效成分包括槲皮素、川陈皮素、柚皮素等，交集基因包括STAT3、VEGFA、IL6、IL1β、PTGS2、TNF等171个，参与细胞活性调节、细胞及信号通路凋亡调节、蛋白酶激活与结合、DNA转录等生物进程，主要参与的信号通路有AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt通路、NF-κB通路、JAK-STAT通路、cGMP-PKG通路等。结论：香砂六君子汤治疗功能性消化不良的作用机制可能与调节胃肠动力、抑制胃肠道炎症反应、调控交感神经敏感性等有关。

香砂六君子汤；功能性消化不良；网络药理学

引言

功能性消化不良（FD）以餐后上腹部饱胀不适、早饱、上腹痛、上腹烧灼感等表现为主，而无器质性改变[1]。当前FD的发病率较高，有调查显示，FD的全球患病率在11.5%～14.5%，且各地区差距较大，我国缺乏全国范围内的流行病学调查，但根据各地区调查显示FD的发病率在18.4%～23.3%[2]。

香砂六君子汤出自《古今名医方论》，主治气虚肿满，脾胃不和之证。在2017年制定的功能性消化不良指南中，选用香砂六君子汤治疗脾虚气滞型FD[3]。

网络药理学结合了网络生物学、分子药理学、多向药理学、计算生物学等多学科的技术和内容，通过构建疾病-基因-药物的多层次网络，分析预测药物与疾病在基因层面上的相互作用关系[4]。中药复方通过各成分协调发挥治疗疾病的作用，通过网络药理学可以反映出各成分之间的相互作用关系，更好地解读中药复方对疾病的作用机理[5]。

1 方法

1.1 获取香砂六君子汤有效成分靶点信息

登录TCMSP（https://www.tcmsp-e.com/）网站分别以“白术”“半夏”“陈皮”“甘草”“木香”“人参”“砂仁”“茯苓”，限定口服生物利用度（OB）≥20%，药物相似度（DL）≥0.10，得到药物有效成分靶点蛋白质名称。通过UniProt（https://www.uniprot.org/）得到的蛋白质转化为对应的基因，得到香砂六君子汤有效成分靶点基因信息。

1.2 构建香砂六君子汤“有效成分-靶点”网络

使用Cytoscape 3.9.1构建香砂六君子汤的“有效成分-靶点”网络图。

1.3 获取功能性消化不良疾病靶点信息

在Gene Cards（https://www.genecards.org/）中以“functional dyspepsia”为关键词进行相关靶点检索，选取Relevance score≥3的疾病相关靶点基因。

1.4 筛选香砂六君子汤与功能性消化不良相关靶点信息

将“1.1”节获取的香砂六君子汤靶点信息与“1.3”节获得的功能性消化不良靶点信息通过Venny2.1（https://bioinfogp.cnb. csic.es/tools/venny/）进行交集对比分析得到香砂六君子汤治疗功能性消化不良相关靶点信息。使用Cytoscape 3.9.1构建“有效成分-疾病-靶点”网络。

1.5 构建香砂六君子汤治疗功能性消化不良的蛋白互作网络

将“1.4”节获得的相关靶点导入String11.5（https://cn.string- db.org/）数据库，种属设定为“Homo sapiens”，置信度设置为0.4，构建蛋白互作网络，导出TSV格式文件，运用Cytoscape3.9.1中的cytoHubba插件以Degree值筛选得到前10位靶点基因。

1.6 GO富集分析及KEGG富集分析

将“1.4”节获得的相关靶点导入Matescape（http://metascape.org/）进行KEGG分析及GO Biological Processes、GO Cellular Components、GO Molecular Functions三项GO富集分析。

2 结果

2.1 香砂六君子汤活性成分及靶点基因

在TCMSP中检索获得有效成分：白术14个、半夏30个、陈皮9个、茯苓21个、甘草125个、木香35个、人参66个、砂仁28个，去除重复及未检索到靶点蛋白的成分，共210个有效活性成分，通过Uniprot转换得到人源靶点基因286个。

2.2 “药物-有效成分-靶点”网络

将香砂六君子汤的210个有效活性成分及286个靶点基因导入Cytoscape 3.9.1中，绘制“药物-有效成分-靶点”可视化网络（图1）。该网络包含504个节点，2866条节点相互联系的边。图中菱形节点代表靶点基因，圆形代表药物有效活性成分及药物，与节点相连的边越多，其degree值越多，所代表节点越重要，相应节点面积越大。

图1 香砂六君子汤“药物-有效成分-靶点”网络图

2.3 “有效成分-疾病-靶点基因”网络

在Gene Cards中检索得到功能性消化不良靶点基因2533个，以Relevance score≥3为标准筛选获得功能性消化不良靶点基因1227个。分别将功能性消化不良靶点基因与香砂六君子汤靶点基因导入Venny2.1交集分析得到171个交集靶点，并制作韦恩图（图2）。将与交集靶点有联系的183个香砂六君子汤的有效活性成分及交集靶点导入Cytoscape3.9.1构建“有效成分-疾病-靶点基因”网络（图3），得到356个节点，1853条边。以圆形代表靶点，菱形代表有效成分，分析degree值越多，其节点面积越多。前6位的有效成分为甘草中的GC19（quercetin）、GC14（formononetin），甘草和人参中的共同成分K1（kaempferol），半夏和砂仁中的共同成分F2（oleic acid），陈皮中的CP2（nobiletin），陈皮和甘草中的共同成分G1（naringenin）。

图2 “药物-疾病”韦恩图

图3 香砂六君子汤治疗功能性消化不良的“有效成分-疾病-靶点”网络图

2.4 香砂六君子汤治疗功能性消化不良的蛋白质互作网络

将171个交集靶点上传至String11.5数据库，设定“Homo sapiens”种属，置信度0.4，得到相应蛋白互作网络图（图4）。将String分析结果导入Cytoscape3.9.1，采用MCC算法筛选得到前10位靶点基因（图5）。

图4 蛋白互作网络图

图5 前10的交集基因（颜色越深，蛋白之间相互联系越紧密）

2.5 KEGG Pathway 富集分析

将香砂六君子汤治疗功能性消化不良的交集靶点基因上传至Matescape网站，选择KEGG Pathway富集分析，设置＜0.05，筛选出218条信号通路，选取前20条信号通路上传至微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）网站制作富集气泡图（图6）。

2.6 GO富集分析

将香砂六君子汤治疗功能性消化不良的交集靶点基因上传至Matescape网站，分别选择GO Biological Processes、GO Cellular Components、GO Molecular Function进行富集分析，设置＜0.05，分别筛选显著性前10的富集结果，其中生物过程（BP）包括对激素、外来刺激、伤害等反应、细胞对脂质的反应、细胞活性的调节、细胞及信号通路凋亡的调节等，细胞成分（CC）包括膜筏、转录调控复合体、囊腔、受体复合体、内质网膜、细胞外基质、蛋白酶抑制剂复合物等，分子功能（MF）包括DNA转录因子结合、受体配体活动、蛋白激酶活性、蛋白酶结合等。将结果上传至微生信网站制作条形图（图7）。

图6 KEGG富集气泡图

图7 GO富集分析条形图

3 讨论

功能性消化不良的发病机制主要包括HP感染，以及胃动素、胃泌素、胆囊收缩素等脑肠肽物质分泌异常，肠道菌群失调等导致胃肠运动功能障碍出现胃容受性舒张功能受损、胃排空延长等，出现餐后饱胀不适、早饱等，上腹痛、上腹部烧灼感则多与内脏高敏感、十二指肠炎症等因素有关[6]。中医根据FD的临床表现将其归属于“痞满”“胃脘痛”的范畴，病位在胃，以脾胃虚弱为本，气滞、血瘀、痰浊、食积为标，本虚标实，虚实夹杂，以脾虚气滞，胃失和降为主要病机[3]。香砂六君子汤出自《古今名医方论》，方由六君子汤加木香、砂仁而成。人参、甘草益气健脾，白术、茯苓健脾燥湿，半夏、陈皮理气化痰，木香、砂仁理气醒脾，使全方补而不滞，健脾消积并重，重在调理中焦气机升降，共奏健脾理气化痰之功。

邱晓静[7]使用香砂六君子汤治疗脾胃虚弱型功能性消化不良患者与多潘立酮对照组相比，脑钠肽NO、NT水平降低，胃排空速率加快，治疗总有效率优于对照组。赵静怡等[8]研究发现，香砂六君子汤可以降低大鼠十二指肠TRPV1、5-HT的表达，抑制脑-肠轴神经传导通路激活，从而抑制内脏高敏感，缓解FD症状。采用网络药理学研究方法探讨香砂六君子汤治疗FD的机制，筛选得相关作用靶点171个。

根据“有效成分-疾病-靶点基因”网络显示，甘草中所含的槲皮素（quercetin）、芒柄花黄素（formononetin），甘草、人参中含有的山柰酚（kaempferol），半夏、砂仁中含有的油酸（oleic acid），陈皮中含有的川陈皮素（nobiletin），陈皮、甘草中含有的柚皮素（naringenin）等与基因联系较紧密，在整个网络中占据重要作用。钟子劭等[9]研究发现白术、人参、茯苓、甘草所组成的四君子汤可以调节CNP-NPR-B-cGMP通路，降低FD大鼠血清CNP含量，抑制大鼠平滑肌组织中NPR-B的表达，使cGMP生成减少，从而提高胃排空能力。蒙毅等[10]通过网络药理学分析认为半夏通过增强Bcl-2表达，同时抑制Bax、Caspase-3表达，抑制细胞凋亡通路，从而恢复胃肠动力。梅全喜等[11]研究发现陈皮中所含有的川陈皮素、橘皮素等黄酮类化合物可促进排出胃液、胃蛋白酶，提高胃蛋白酶活性，同时还可促进小鼠小肠推进、蠕动能力，增强消化作用。熊永建[12]的研究显示，川陈皮素通过调节肌球蛋白磷酸化而对小肠平滑肌收缩性运动产生双向调节作用，同时还可以有效控制肠道炎症反应，对肠粘膜具有保护作用。李佳容等[13]通过网络药理学分析认为，木香-砂仁药对可能通过ACHE、ESR1、ESR2、PTSG2等靶点，发挥抗炎、促进胃排空、改变胃动力、促进胃酸分泌等作用，从而改善FD症状。槲皮素可以有效舒张胃肠道平滑肌[14]。同时其具有明显的抗菌作用，通过降低p38MAPK、BAX，增加BCL-2、IL-8水平来改善HP感染引起的胃部炎症及症状[15]。研究发现，柚皮素具有很好得到抗炎、抗菌作用，可以有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的繁殖，减少免疫损伤等[16]。同时柚皮素可以调控TNF-α、IL-6等细胞因子，调控诸多信号通路，抑制免疫进程[17]。

在香砂六君子汤治疗功能性消化不良的共同靶点基因互作网络中，STAT3、VEGFA、IL6、JUN、CASP3、IL1β、INS、PTGS2、TNF等基因相互联系较紧密。研究发现，IL-6、酪氨酸激酶、TNFα等通过一系列反应激活JAK/STAT3信号通路，参与细胞增殖、分化及炎症，免疫反应等生理过程[18]。IL-6作为细胞免疫因子，与多种急慢性炎症相关，可以诱发肠上皮通透性增加、中性粒细胞浸润等炎性表现，引起组织炎症反应的发生[19]。TNF作为一种炎症介质，分为TNF-α、TNF-β两种亚型，参与介导炎症反应。TNF-α可以激活NF-κB及JNK通路，参与炎症反应及免疫调节，还可诱导细胞增殖、分化，减轻组织细胞损伤[20]。NF-κB通过TLR9受体等参与十二指肠的免疫炎症反应，导致FD的发生[21]。NF-κB激活可以显著诱导NF-α、IL-6等炎症介质的表达增加，同时增加的炎症介质又可以作用与NF-κB信号通路，诱导其活化，形成正反馈调节，进一步加重炎症反应[22]。同时有研究发现，TNF-α、IL-1β可以影响胃容受性舒张功能，导致胃排空延迟，引起FD的发生[23]。VEGFA可以通过ERK、PI3K/Akt通路，诱导血管内皮细胞增殖，参与血管的增殖与再生[24]。

KEGG富集得到218条信号通路，其中癌症通路、脂质及动脉粥样硬化通路、AGE-RAGE通路、PI3K-Akt通路、NF-κB通路、JAK-STAT通路、cGMP-PKG通路等显著性较高，为关键信号通路。AGE-RAGE通路是介导炎症反应的主要通路之一，RAGE是细胞表面分子的免疫球蛋白之一，AGEs为其重要配体，可以直接或间接作用与RAGE受体，诱导其释放IL-1β、TNF-α，并通过激活应激活化蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶、AKT等激活NF-κB，促进释放促炎性因子、黏附分子、生长因子等，引起炎症反应，导致组织损伤等表现[25,26]。PI3K-Akt通路可以诱导细胞增殖、分化，减轻组织损伤。JAK-STAT通路介导多种细胞因子、生长因子的活性，参与调控细胞增殖与分化[27]。cGMP-PKG通路增加交感神经敏感性，产生或加重疼痛[28]。

4 结束语

综上所述，本研究借助网络药理学预测香砂六君子汤治疗FD的信号通路及相关靶点基因，从而探讨其潜在作用机制。推测香砂六君子汤通过槲皮素、川陈皮素、柚皮素等成分，作用于AGE-RAGE通路、PI3K-Akt通路、NF-κB通路、JAK-STAT通路、cGMP-PKG通路等信号通路及STAT3、VEGFA、IL-6、IL-1β、PTGS2、TNF等靶点，改善FD相关症状。但同时受限于数据库信息同实际作用上存在一定的区别，还有待进一步实验验证。

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Study on the Mechanism of Xiangsha Liujunzi Decoction in Treating Functional Dyspepsia Based on Network Pharmacology

Objective: To study the mechanism of Xiangsha Liujunzi decoction in the treatment of functional dyspepsia based on network pharmacology. Methods: The compounds with oral bioavailability (OB)≥20% and drug similarity (DL)≥0.10 in Xiangsha Liujunzi decoction were selected as the active components of the drug through the Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Analysis Platform (TCMSP), and the protein target information was obtained. The functional dyspepsia target genes were screened by Gene Cards database. and the drug disease intersection genes were obtained by Venny 2.1, The "active-ingredient-target" network and the "drug-disease-target" network were constructed by using Cytoscape 3.9.1, the PPI network was constructed by using String 11.5 database, and KEGG pathway enrichment analysis and GO function enrichment analysis were carried out by using Matescape website. Results: The effective components of Xiangsha Liujunzi decoction in the treatment of functional dyspepsia included quercetin, tangerine and naringin, etc., and 171 intersecting genes included STAT3, VEGFA, IL6, IL1β, PTGS2 and TNF etc., which participate in biological processes such as cell activity regulation, cell and signal pathway apoptosis regulation, protease activation and binding, and DNA transcription. The main signal pathways involved are AGE-RAGE signaling pathway, PI3K Akt pathway, NF-κB pathway, JAK-STAT pathway, cGMP PKG pathway, etc. Conclusion: The mechanism of Xiangsha Liujunzi decoction in the treatment of functional dyspepsia may be related to the regulation of gastrointestinal motility, inhibition of gastrointestinal inflammatory reaction and the regulation of sympathetic sensitivity.

Xiangsha Liujunzi decoction; functional dyspepsia; network pharmacology

R285

A

1008-1151(2022)10-0100-05

2022-07-17

罗晶心（1997－），女，重庆人，天津中医药大学第一附属医院在读硕士研究生，研究方向为脾胃病中西医结合治疗。

王威（1971－），男，天津人，天津中医药大学第一附属医院消化科副主任医师，硕士生导师，研究方向为脾胃病中西医结合治疗。