冬凌草甲素调节高糖诱导的人肾小球系膜细胞异常增殖、炎症和纤维化①

米 伟 徐斐翀 宋雨亭 唐 晴 刘 月

（四川省医学科学院·四川省人民医院血液透析中心，成都 610000）

肾小球系膜细胞位于肾小球毛细血管之间，邻近内皮细胞或基底膜，具有分泌细胞基质，支撑肾小球毛细血管丛，产生细胞因子，吞噬或清除大分子物质等功能［1-2］。研究表明，肾小球系膜细胞在高糖、过氧化氢、活性氧、炎症等多种因素刺激下，均可发生氧化应激、免疫应答、纤维化等损伤［3-5］。冬凌草甲素是从唇形科香茶菜属植物碎米亚桠中分离出的一种具有生物活性的天然物质，具有抗肿瘤、抗炎症、抗组织纤维化、免疫调节等多种生物活性［6］。研究表明，冬凌草甲素通过其生物活性在多种肿瘤和细胞中发挥调节作用，例如，冬凌草甲素通过下调炎症因子TNF-α、IL-6表达抑制人角质形成细胞增殖、凋亡和迁移［7］；通过降低TGF-β受体表达调节T细胞的免疫抑制能力，从而抑制乳腺癌细胞生长［8］；通过减弱IL-1β的活化作用抑制人骨关节炎软骨细胞的炎症发生等［9］。但冬凌草甲素在人肾小球系膜细胞（human glomerular mesangial cells，HGMCs）中的研究鲜见报道，因此，本研究通过建立高糖诱导的HGMCs模型，探究冬凌草甲素对HGMCs异常增殖、炎症反应和纤维化的影响，并初步探索其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肾小球系膜细胞系购自上海细胞生物研究所。冬凌草甲素（纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司（货号：B20310-20 mg）；高糖DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibco公司（货号：0030034DJ、H0101、A40009）；CCK8试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、ELISA试剂盒、RT-PCR试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；单克隆抗体及HRP标记的对应二抗均购自美国Abcam公司。台式高速离心机（大龙，D3024R）；成像系统（上海天能科技有限公司，Tanon-1600R）；光学显微镜（日本尼康，Nikon Eclipse E100）；酶标仪（Rayto，RT6100）；RT-PCR仪（北京东胜创新生物科技有限公司，东胜龙ETC811）；流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及培养 将细胞分为健康对照组、模型组、模型+5µg/ml冬凌草甲素组、模型+10µg/ml冬凌草甲素组、模型+20µg/ml冬凌草甲素组，模型处理和剂量依据参考文献［10-11］。健康对照组细胞培养于含5 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清的DMEM培养基中，模型组细胞培养于含35 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清的DMEM培养基中，模型+5、10、20µg/ml冬凌草甲素组细胞分别培养于含35 mmol/L葡糖糖、10%胎牛血清和5、10、20µg/ml冬凌草甲素的DMEM培养基中，各组细胞均在37℃、含5%CO2的培养箱中培养。

1.2.2 CCK8检测细胞增殖倍数 细胞经胰酶消化后，严格按照CCK8试剂盒说明书操作，以5×104个/孔接种于96孔板，每组设3个复孔，置于37℃、含5%CO2的培养箱中培养48 h，并分别于第0、1、2、3、4天向细胞孔内加入20µl CCK8溶液。酶标仪测各孔450 nm处吸光度值。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集对数生长期的HGMCs，制备细胞悬液，取100µl细胞悬液于1.5 ml离心管，加入5µl Annexin V-FITC混匀后室温避光孵育10 min，加入10µl 20µg/ml的PI溶液，采用流式细胞仪进行分析。以Annexin V-FITC为横坐标，PI为纵坐标，B2象限为晚期凋亡细胞，B3象限为正常细胞，B4象限为早期凋亡细胞。

1.2.4 RT-PCR检测TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β、纤维粘连蛋白（fibronectin，FN）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）mRNA水平 收集对数生长期的HGMCs，制备细胞悬液并以4℃、3 000 r/min离心15 min，采用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度，按逆转录试剂盒说明书合成cDNA，然后按照RT-PCR试剂盒配制反应体系，于PCR扩增仪进行扩增（95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸2 min，循环40次后，72℃延伸5 min）。以目的基因和内参比值表示mRNA相对表达水平，采用2-ΔΔCt法分析结果。TNF-α正 向 引 物：5'-AACAAGGAGGAGAAGTTCCCAAATG-3'，反向引物：5'-CTCCGCTTGGTGGTTTGCTA-3'；IL-6正向引物：5'-GACTGATGTTGCTGACAGCCACTGC-3'，反向引物：5'-TAGCCACTGCTTCTGTGACTCTAACT-3'；IL-1β正向引物：5'-GTCTTTCCCGTGACCTTC-3'，反向引物：5'-ATCTCGGAGCCTGTTAGTGC-3'；TGF-β正向引物：5'-GGCTACTTTGCCAACTACTGC-3'，反向引物：5'-GACGAGGTGGAACACAACG-3'；FN正向引物：5'-CATTCAACAAGAAACCACT-3'，反向引物：5'-TCTGTCACTTCCACAAACT-3'；α-SMA正向引物：5'-AACCACACCTAAAAGAAAAC-3'，反向引物：5'-CTGACCAAATGGCAGAACAT-3'；β-actin正 向 引物：5'-CCCATCTACGAGGGCTAT-3'，反向引物：5'-TTGCACGCACGATTTCC-3'。

1.2.5 ELISA检测TNF-α、IL-6和IL-1β含量 取对数生长期的HGMCs，制备细胞悬液并以4℃、3 000 r/min离心15 min取上清液，设置空白对照孔，反应孔加入样品液，37℃孵育40 min，洗涤液洗涤3次，每次2 min，然后加入生物素标记的抗体，37℃避光孵育30 min，洗涤3次后加入链霉亲和素混匀，37℃避光孵育30 min，最后加入显色剂避光显色10～15 min，滴加终止液终止反应，终止反应后5 min内采用酶标仪检测450 nm处吸光度值。

1.2.6 免疫荧光和试剂盒检测ROS、SOD和MDA含量 将对数期的HGMCs制成细胞悬液，接种于12孔板，每孔接种5×104个细胞，待细胞贴壁融合至90%时，取出盖片，PBS洗涤3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定细胞，常温下静置15 min，PBS洗3次，每次5 min，常温下静置15 min，后用山羊血清封闭于37℃孵育60 min；滤纸吸净封闭液，加入ROS一抗4℃孵育过夜。第2天于37℃下再孵育60 min，PBS洗涤3次，每次5 min。于暗室中加入FITC二抗，37℃避光孵育60 min，PBS洗涤3次，每次5 min。以0.5µg/µl的DAPI覆 盖 细 胞，常 温 下 避 光 静 置5 min，PBS洗涤3次，每次5 min，甘油封片，荧光显微镜下观察拍照。常温下按试剂盒说明测定SOD和MDA含量。

1.2.7 Western blot检测TGF-β、FN、α-SMA、TLR4、MyD88和p-P65蛋白水平 收集对数生长期的HGMCs，胰酶消化细胞。RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定细胞蛋白浓度，经10%SDS-PAGE电泳、转膜、脱脂奶粉封闭后，加入TGF-β（1∶200）、FN（1∶200）、α-SMA（1∶400）、TLR4（1∶200）、MyD88（1∶200）和p-P65（1∶400）抗体，4℃下摇床孵育过夜。加入按比例稀释HRP标记的对应二抗（1∶1 000），室温孵育2 h。采用ECL化学发光法于暗室下曝光显影（β-actin作内参）。将胶片进行扫描存档，Photoshop整理去色，Alpha软件分享光密度值。

1.3 统计学处理 所有实验独立重复3次，取平均值，数据处理采用SPSS17.0软件进行分析，正态分布的计量资料表示为±s。采用单因素方差分析，若方差齐则两两比较采用LSD法，若方差不齐则两两比较采用Dunnettt法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冬凌草甲素对HGMCs增殖和凋亡的影响 与健康对照组相比，模型组细胞增殖倍数增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，5µg/ml冬凌草甲素组细胞增殖倍数差异无统计学意义，10µg/ml和20µg/ml冬凌草甲素组细胞增殖倍数显著降低（P＜0.05），见图1A。流式细胞术检测HGMCs凋亡率，与健康对照组［（4.6±0.5）%］相比，模型组［（5.0±0.8）%］细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组相比，5µg/ml冬凌草甲素组［（5.0±1.2）%］细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05），10µg/ml［（28.6±3.6）%］和20µg/ml［（39.0±4.1）%］冬凌草甲素组细胞凋亡率显著提高（P＜0.05），见图1B、C。

图1 CCK8和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡率Fig.1 CCK8 and flow cytometry to detect cell proliferation and apoptosis rate

2.2 冬凌草甲素对HGMCs炎症因子含量的影响与健康对照组相比，模型组细胞上清液中TNF-α mRNA［（4.3±0.5）pg/ml］和蛋白［（15±4）pg/ml］水平均显著升高（P＜0.05），IL-6 mRNA［（2.7±0.4）pg/ml］和蛋白［（9±7）pg/ml］水平均显著升高（P＜0.05），IL-1βmRNA［（3.8±0.2）pg/ml］和蛋白［（18±6）pg/ml］水平均显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，5µg/ml冬凌草甲素组TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA和蛋白含水平差异均无统计学意义（P＞0.05），10µg/ml和20µg/ml冬凌草甲素组细胞上清液中TNF-αmRNA［（2.8±0.4）pg/ml和（1.5±0.1）pg/ml］和蛋白［（57±7）pg/ml和（23±12）pg/ml］水平显著降低（P＜0.05），IL-6 mRNA［（1.8±0.6）pg/ml和（1.2±0.3）pg/ml］和蛋白［（27±9）pg/ml和（14±5）pg/ml］水平均显著降低（P＜0.05），IL-1βmRNA［（2.9±0.4）pg/ml和（1.4±0.2）pg/ml］和蛋白［（59±6）pg/ml和（31±7）pg/ml］水平均显著降低（P＜0.05），见图2。

图2 RT-PCR和ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA水平和蛋白含量Fig.2 RT-PCR and ELISA to detect TNF-α，IL-6，IL-1β mRNA levels and protein contents

2.3 冬凌草甲素对HGMCs氧化应激指标的影响与健康对照组相比，模型组ROS［（2±1）U/ml］含量差异无统计学意义，SOD［（2.4±0.4）U/ml］含量显著减少（P＜0.05），MDA［（4.5±0.3）U/ml］含量显著增多（P＜0.05）。与模型组相比，5µg/ml冬凌草甲素组ROS、SOD和MDA含量差异均无统计学意义（P＞0.05），10µg/ml和20µg/ml冬凌草甲素组ROS［（9±3）U/ml和（19±4）U/ml］含量和SOD［（3.5±0.5）U/ml和（4.2±0.4）U/ml］含量显著增多（P＜0.05），MDA［（3.6±0.4）U/ml和（2.5±0.6）U/ml］含量显著减少（P＜0.05），见图3。

图3 免疫荧光和试剂盒检测ROS、SOD和MDA含量Fig.3 Immunofluorescence and kits to detect ROS，SOD and MDA contents

2.4 冬凌草甲素对HGMCs纤维化水平的影响 与健康对照组相比，模型组TGF-βmRNA（3.44±0.32）和蛋白（0.92±0.06）水平显著上调（P＜0.05），FN mRNA（3.65±0.44）和蛋白（0.38±0.08）水平显著上调，α-SMA mRNA（4.23±0.38）和蛋白（0.43±0.05）水平显著上调（P＜0.05）。与模型组相比，5µg/ml冬凌草甲素组TGF-β、FN和α-SMA mRNA和蛋白水平差异均无统计学意义（P＞0.05），10µg/ml和20µg/ml冬 凌 草 甲 素 组TGF-βmRNA（2.46±0.26、1.32±0.16）和蛋白（0.48±0.06、0.07±0.03）水平均显著下调（P＜0.05），FN mRNA（2.28±0.33、1.58±0.28）和蛋白（0.09±0.02、0.03±0.01）水平均显著下调（P＜0.05），α-SMA mRNA（2.53±0.38、1.64±0.22）和蛋白（0.13±0.05、0.05±0.02）水平均显著下调（P＜0.05），见图4。

图4 RT-PCR和Western blot检测TGF-β、FN和α-SMA mRNA和蛋白水平Fig.4 RT-PCR and Western blot detection of TGF-β，FN andα-SMA mRNA and protein levels

2.5 冬凌草甲素对HGMCs TLR4/MyD88和P65磷酸化的影响 与健康对照组相比，模型组TLR4（0.38±0.08）、MyD88（0.68±0.07）和p-P65（0.16±0.05）蛋白水平显著上调（P＜0.05）。与模型组相比，5µg/ml冬凌草甲素组TLR4、MyD88和p-P65水平差异均无统计学意义（P＞0.05），10µg/ml和20µg/ml冬凌草甲素组TLR4（0.07±0.03、0.03±0.02）、MyD88（0.23±0.06、0.06±0.04）和p-P65（0.06±0.03、0.02±0.01）蛋白水平均显著下调（P＜0.05），见图5。

图5 Western blot检测TLR4/MyD88和p-P65蛋白水平Fig.5 Western blot detection of TLR4/MyD88 and p-P65 protein levels

3 讨论

冬凌草甲素的主要成分是四环二萜类有机化合物，常用于消热解毒、消炎止痛、活血化瘀等［12-13］。研究表明，冬凌草甲素通过TLR4/MyD88/NF-κB通路在多种肿瘤和细胞炎症、免疫调节中发挥调控作用［14］。本研究通过高糖诱导HGMCs模型，探究冬凌草甲素在HGMCs增殖、凋亡、氧化应激、炎症反应和纤维化中的调节作用及其作用机制。结果发现，冬凌草甲素能够抑制高糖诱导的HGMCs增殖、炎症因子表达和纤维化，促进细胞凋亡和氧化应激，并下调TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白水平。提示冬凌草甲素在高糖诱导的HGMCs中具有调节作用。

HGMCs异常增殖是引起系膜增生性肾小球肾炎的主要病理因素，高糖可抑制肾小球系膜细胞功能，引起系膜细胞自噬能力降低，导致细胞中损伤的大分子和细胞器不能被清除造成肾脏损伤，随着病程进一步加重最终发生终末期肾病［15］。本研究结果显示，高糖诱导的HGMCs增殖能力明显被抑制，细胞凋亡率显著增加。提示冬凌草甲素通过抑制HGMCs增殖并促进细胞凋亡在多种肾病中发挥调节作用。

炎症反应和氧化应激是肾小球系膜细胞发生病变的主要因素，TNF-α是由巨噬细胞和单核细胞分泌的促炎细胞因子，与多种疾病的发生发展密切相关。IL-6是由活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子，参与调节细胞免疫应答，同时，IL-6在多种炎症性疾病中也发挥重要作用［16］。IL-1β是由活化的巨噬细胞和单核细胞产生的淋巴细胞刺激因子，其通过结合细胞表面的受体参与调控细胞免疫和炎症反应。研究发现，TNF-α、IL-6、IL-1β在HGMCs中的高表达与细胞炎症和免疫紊乱相关［17］。高糖环境会诱导肾小球系膜细胞活化，激活氧化应激反应，诱导肾小球系膜细胞内ROS和MDA过量产生及SOD失活，使得肾小球系膜细胞抗氧化能力下降［18］。TGF-β、FN和α-SMA是细胞纤维化的重要指标，在肾小球系膜细胞病变过程中起到促进作用［19］。本研究结果显示，经冬凌草甲素处理后，高糖诱导的HGMCs炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β显著降低，氧化应激水平明显降低，纤维化水平也显著降低。提示冬凌草甲素可能通过降低高糖诱导的HGMCs炎症因子水平、氧化应激指标和纤维化水平调节细胞损伤。

为进一步明确冬凌草甲素调节高糖诱导的HGMCs异常增殖、氧化应激、炎症和纤维化的作用机制，本研究还初步检测了TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表达情况及纤维化水平，Toll样受体4（Tolllike receptor 4，TLR4）是天然免疫系统中的关键调节因子，髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是TLR信号通路中的关键接头分子，调节传递上游信息和疾病发生发展。NF-κB在炎症反应、免疫应答等过程中起关键作用。TLR4/MyD88/NF-κB通路在多种疾病中发挥调控作用，TLR4通过与相应配体的结合触发下游信号转导途径（如MyD88）导致NF-κB活化从而调节细胞因子分泌和炎症反应发生［20-21］。郝健等［22］发现，TLR4/MyD88/NF-κB在肾小球系膜细胞中表达显著增加，经给药处理后，TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白及炎症细胞因子IL-6和IL-1β表达显著降低。本研究结果显示，经冬凌草甲素处理后，高糖诱导的HGMCs中TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表达显著降低，纤维化水平也显著降低。

综上所述，冬凌草甲素在高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖、炎症、氧化应激和纤维化中具有调节作用，其作用机制可能与下调TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表达有关，后续课题组将进一步探究冬凌草甲素通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路调控HGMCs异常增殖、炎症、氧化应激和纤维化的具体作用机制。