肌少症造模方法的研究进展

周晓宁 袁帅赵启叶洁 莫文 许金海*

1. 河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院) ，河南 郑州 450000 2. 上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032 3. 上海中医药大学脊柱病研究所，上海 200032

肌少症是指由于肌纤维萎缩和丧失导致的肌肉功能和质量下降的老年综合征，可增加老年人跌倒和骨折的风险。据统计，至2018年我国60岁以上人口高达25%，预计2050年65岁以上人口将超过4亿[1]。60～70岁人群肌少症发病率为5%～13%，80岁以上将高达11%～50%[2]。目前肌少症的治疗主要为抗阻训练及营养补充[3]，安全性与疗效性高的治疗方案仍然是医学范围内需继续探索的领域。在对其进行诊疗研究的过程中，选择适宜的动物模型至关重要。随着对肌少症研究的深入，造模方法逐渐多样化，文献报道有悬吊法、药物注射法、手术法、转基因技术等。探索出更接近人类肌少症发病机制与表现的动物模型是研究的关键步骤，故拟通过查阅文献，总结并探讨各造模方法的利弊，以期为肌少症的诊断、治疗奠定实验学基础。

1 肌少症模型的评定标准

研究表明肌少症与肌纤维数量和横截面积下降及蛋白质净降解、炎症反应加剧、肌肉调控因子失调等因素密切相关，表现为肌量减少、肌力下降和肌肉功能减退。以骨骼肌质量下降、肌力减弱为评判指标。动物模型肌肉质量的检测与人类相仿，可通过生物电阻抗(BIA)、磁共振(MRI)、双能X线(DXA)等仪器检测；肌肉的力量和功能可通过测量前肢抓力和转棒式疲劳仪评估[4]。

2 肌少症造模方法

2.1 转基因技术造模法

2.1.1转基因过表达人源肿瘤坏死因子基因小鼠：随着基因技术的发展，转基因技术在造模方面有较多应用。小鼠的基因可控性为基因敲除和转基因的实验方法提供便利。研究[2]表明炎症因子如TNF-α、IL-1β 、IL-6 、TGF-β等在骨骼肌过多积累可导致肌肉萎缩，从而导致肌少症的发生。依香叫等[5]通过转基因技术，用人类血红蛋白P基因序列(human hemoglobinbeta,HBB)取代修饰小鼠聚腺苷酸化信号和侧翼序列，最终形成转基因过表达人源肿瘤坏死因子基因(human tumour necrosis factor,hTNF)的小鼠，此种修饰确保了TNF-α的转录效率，导致肌肉萎缩，最终发展为肌少症。

2.1.2(Pro)肾素受体转基因小鼠：Wnt/β-catenin信号通路在胚胎发生、癌变和干细胞自我更新、分化中发挥重要作用。该通路可促进衰老，并与肌肉细胞再生能力下降有关。(Pro)肾素受体[(P) RR]是Wnt/β-catenin信号通路的激活物。(P)RR通过增加肾素的催化活性来提高血管紧张素I的生成。骨骼肌中(P)RR过表达可激活Wnt/β-catenin和YAP信号通路，从而损伤肌肉修复过程中成肌细胞融合，导致骨骼肌生长紊乱。研究[6]发现(P)RR转基因(Tg)小鼠可表现出独特的骨骼肌萎缩，并伴有肌少症特征，可作为肌少症的造模方法。

2.1.3MKR小鼠与Akt1 /Akt2 双敲除小鼠：MKR小鼠是转基因2型糖尿病小鼠，其抗疲劳、耐缺氧、麻醉耐受能力均较差，目前较多用于糖尿病的研究。MKR小鼠骨骼肌中由于IGF-1受体缺失，影响小鼠的肌肉发育生长。Mavalli等[7]发现，MKR小鼠在 6 周龄和16 周龄肌纤维横截面积均明显低于野生型小鼠。此外，Akt1 /Akt2 双敲除的小鼠也表现出严重的生长缺陷及骨骼肌萎缩，与 IGF-1 受体缺失小鼠类似[8]。尽管这两种类型的小鼠都表现出肌肉萎缩，但 Akt 双敲除的小鼠主要表现为肌细胞尺寸减少，而 IGF-1 缺失的小鼠则表现为肌细胞数量的减少[9]。

2.2 试剂注射法

2.2.1地塞米松注射法：地塞米松(dexamethasone，DXM) 属于糖皮质激素，一定剂量的DXM具有抗炎、抗过敏的功效，持续大剂量的DXM则会造成肌肉萎缩。已有研究[9-11]发现对小鼠皮下注射DXM，维持10～19 d，小鼠的肌肉质量和功能明显下降，可作为肌少症造模的方案。

2.2.2肉毒毒素A注射法：肉毒毒素A(botulinum toxin，BTX) 是一种高分子蛋白毒素，运动神经元传导神经冲动后，释放乙酰胆碱，经终板电位改变后出现肌肉动作电位，产生肌肉收缩。BTX通过作用于神经肌肉接头突触前，阻断神经介质乙酰胆碱的运转、融合和释放，使肌肉麻痹，从而导致肌肉的快速丢失[12]，也被应用于建立肌少症模型。此外，通过高脂饮食配合药物注射造模可促进小鼠肌肉萎缩，朱国涛等[13]的研究便是给予小鼠高脂高糖饮食并注射链脲佐菌素构建糖尿病肌少症小鼠模型。

2.2.3手术法：手术法主要包括全胃切除术、坐骨神经切除术及卵巢切除术。Haba Y等[14]通过全胃切除构建大鼠肌少症模型，全胃切除大鼠可出现体重减轻、肌肉质量减少和肌肉萎缩。根据实验动物的肌肉重量、肌肉萎缩标志物表达、蛋白质合成标志物表达和血液参数，研究发现支链氨基酸(branched-chain amino acids，BCAA)和谷氨酰胺(glutamine，Glu)可抑制atrogen -1或MuRF1，并具有协同效应，进而可抑制小鼠体重下降和肌肉萎缩。Kinoshita H等[15]通过切除坐骨神经诱发肌肉萎缩，建立肌肉减少症动物模型。但肌纤维去神经支配是否与肌肉细胞或神经元的有害变化有关，或与两者都有关系，目前尚不清楚。部分学者[16]认为雌性大鼠卵巢切除术可作为肌少症建模法，但是随着雌激素水平的下降，实验动物的肌肉质量及骨量均受影响，该法更适用于活动障碍综合症的造模。

2.3 物理造模法

2.3.1后肢悬吊法：后肢悬吊法(hind limb suspension，HLS)通过后肢悬吊模拟微重力条件造成肌肉质量和力量均降低，成为废用性肌肉萎缩模型[17-18]。有研究[19]发现大鼠后肢悬吊4周后，比目鱼肌和跖肌的收缩张力和质量下降约50%。该法的优点是无需药物干预，对实验动物整体影响较小。但是HLS造模的小鼠，I型慢速肌纤维的减少比II型快速肌纤维的减少更明显，这种微重力状况下的肌肉萎缩与老年人肌少症病理机制并不相符[20]。

2.3.2关节位置固定法：关节位置固定部位的肌肉失去收缩舒张等活动，从而引起肌肉萎缩 ，此方法常被用作模拟骨折后的石膏、绷带固定。大鼠被固定关节限制活动一段时间后，会造成大鼠肌肉的废用性萎缩，从而建立大鼠肌少症模型。Ohira等[21]的研究对成年Wistar大鼠进行后肢固定，经过10 d的固定就成功造成了比目鱼肌出现废用性萎缩。

2.3.3直接选材法：虽然较多造模方法可以使实验动物肌肉萎缩和功能下降，但是与实际肌少症的病理机制仍存在一定的差异。研究[25]发现18月龄小鼠可成功建立自然衰老小鼠模型，其运动能力明显下降，且骨骼肌萎缩以II型肌细胞为主，与肌少症病理变化更相符。单纯自然衰老模型造模时间较长，越来越多的研究[22]通过衰老+高脂饮食以缩短造模时间，高脂饮食使身体脂肪组织明显增加，增强肌肉组织内炎症反应，进而加重骨骼肌的萎缩、老化，使骨骼肌纤维变细，肌肉力量减退。有学者[23]予小鼠高脂饮食 (high-fat diet，HFD)后发现小鼠的脂肪组织明显增加而肌肉组织减少、肌力明显下降，并且以IL-6、TNF-α为代表的炎症指标增加。

2.3.4加速衰老模型：研究骨骼肌衰老最常用的动物模型是大鼠和小鼠。然而，即使在啮齿动物中，进行终生干预仍需要18～26个月的随访，成本高且耗时长，而加速衰老模型在一定程度上可节约时间和成本。加速衰老小鼠(senaging - accelerated Mouse, SAM)由18个品系组成，根据寿命、衰老评分和病理表型数据，通过亲本AKR/J小鼠重复选择性近交，建立具有加速衰老和衰老相关病理的衰老倾向自交系(SAMP)及由具有正常衰老的抗衰老自交系(SAMR)组成的SAM模型[24]。其中11个衰老易感自交系(senaging -prone inbred strain, SAMP)和7个抗衰老自交系(senaging -resistant inbred strain, SAMR)被认为是肌少症研究的良好选择[25]。其中SAMP8由于其高氧化应激状态，表现出加速肌肉老化、肌肉质量下降、寿命短的典型特征，相较于SAMP6能够更早、更快的出现肌肉质量和力量的下降，且肌肉萎缩以II型肌纤维为主[16]，与人类肌少症病理变化相一致，因此SAMP8小鼠是研究肌少症较理想的动物模型[26-27]。

3 讨论

综上所述，随着对肌少症研究的深入，造模时间短、存活率高、方便干预且病理机制与人类相符的造模方法逐渐成为研究热点。转基因技术造模法的指向性更明确，但对实验研究者的技术要求高，转基因小鼠存活率也是需纳入考虑的因素之一；试剂注射造模方法简单，注射剂量及药物便于控制，可重复性高。然而单纯注射造模可能对多系统产生作用，尤其部分药物在对肌肉产生作用的同时，往往伴有骨质丢失，该法与手术法均能对肌肉和骨骼产生作用，此类造模方式更贴近活动障碍综合征。且目前对试剂选用、药物剂量和注射周期缺乏统一标准，副作用尚不明确；物理造模法无需药物干预，造模简便且易于操作，与废用性肌肉萎缩存在一定程度相似性。但是此类方法在肌肉萎缩过程中，I型慢速肌纤维的减少量大于II型快速肌纤维，其肌肉衰减所表现出的症状与老年人不相符。不仅如此，目前关于使用关节位置固定法进行大鼠肌少症建模的研究仍较少，其固定方式和固定干预时间仍需进一步的研究探讨；直接选材法与肌少症发病机制的一致性较好，且病变以炎性反应增加、II型肌细胞萎缩为主，有着自身的优势。但成本高、造模时间长也限制了其推广应用；加速衰老模型弥补了直接选材法的不足，SAMP8小鼠是研究肌少症较理想的动物模型。

4 小结

骨骼肌具有调节能量代谢、维持温度、支配活动、保护器官等重要生物学功能，在人类中，骨骼肌约占体重的40 %，年龄和慢性病中的肌纤维萎缩与丧失是导致丧失独立能力、残疾、需要长期护理以及总体死亡率升高的主要因素[1,28-29]。研究表明转基因技术、炎症反应失调、高脂饮食、废用性萎缩、手术干预、药物注射均可诱发肌少症，然而各造模方法均有优缺点，需要视情况选择。笔者认为在具有技术支持及可实施的基础上，SAMP8小鼠是研究肌少症的较好模型。自然衰老造模法次之，该法的病理改变、症状与肌少症的一致性良好，然而存在时间久、成本高的缺点。探索出一种时间短、成本低并且能够高度模拟人体肌少症的模型仍是未来需要研究的方向。