莪术醇抗肿瘤作用机制研究进展

王中会，闫平慧，晁 旭，2*

（1.陕西中医药大学基础医学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712046）

肿瘤是全球范围内高死亡率、低存活率的一种致命疾病，目前仍然没有一种已知的方法可治愈大多数癌症。据国际癌症研究机构统计，2020年全球有将近1 930万例新癌症病例和1 000万例癌症死亡病例[1]。已经开发了超过1 100种用于治疗人类恶性肿瘤的抗癌药物[2]。然而，由于许多不可避免的严重副作用限制了这些药物的使用。在某些情况下，特别是在长期治疗的情况下患者在治疗期间可能会产生多药耐药性。越来越多的临床前试验和市场上的癌症治疗药物转向低毒、高效、耐药的天然药物。中医药治疗肿瘤已有数千年的历史，大量研究证明，与标准化疗药物相比，中药在抑制肿瘤发生发展、延长生存期、减少化疗和放疗副反应、提高肿瘤患者生活质量等方面是有用和有效的。因此，中医药已成为挖掘创新天然成分作为抗肿瘤靶向治疗药物的重要来源。

莪术醇是莪术精油中的主要活性成分之一，大量研究证实莪术醇具有广谱抗癌特性，可治疗肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、大肠癌、鼻咽癌、卵巢癌等多种癌症，而莪术醇对正常细胞的作用可以忽略不计，这表明它在癌症治疗中具有潜在的治疗作用[2]。本研究综述近几年来莪术醇对不同肿瘤的抗肿瘤作用机制的研究进展。

1 抑制肿瘤细胞的恶性生物学行为

1.1 莪术醇抑制细胞增殖、生长，诱导凋亡

Tang等[6]研究发现，莪术醇对SPC-1-A人肺腺癌细胞具有时间和浓度依赖性的抗增殖作用，浓度为100 μM时，即能诱导SPC-1-A细胞大量凋亡，并将细胞周期阻滞在G0/G1期，而对MRC-5人胚胎肺成纤维细胞（非转化细胞）的生长抑制作用不大。该体外抗肿瘤增殖作用在荷瘤小鼠实验中得到证实，60 mg·kg-1·d-1莪术醇即可显著减小肿瘤体积，且无明显毒性。

胰岛素样因子-1受体（insulin-like factor-1 receptor，IGF-1R）参与许多组织，主要调节生长和存活，是公认的恶性细胞的独特因子。因此，IGF-1R阻断剂可以抑制肿瘤生长、血管生成并增强化疗诱导的细胞凋亡。p38 MAPK是恶性转化的负调控因子，在肿瘤细胞中具有促凋亡作用[7]。Wang等[8]发现，莪术醇可抑制大肠癌LoVo细胞增殖并诱导其凋亡，其机制主要是通过降低IGF-1R水平，上调p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化水平，进而上调Bax表达，降低CREB1和Bcl-2表达，触发PARP切割来实现的，该结论在体内实验中得到了验证。

据Huang等[9]报道，莪术醇能抑制三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）MDA - MB 231细胞的体内外生长。体外实验表明莪术醇通过上调p73、PUMA和Bak的表达，下调突变型p53触发凋亡来够抑制TNBC MDA-MB 231细胞的生长。体内实验表明，莪术醇剂量为100或200 μg·kg-1，给药连续21 d可显著抑制异种移植瘤的体内生长。

有研究[10]表明，药物通过线粒体膜电位（MMP）的缺失和活性氧（ROS）生成的增加诱导细胞凋亡。当体内ROS表达增加时，可对恶性细胞造成损害。而异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）依赖的还原羧化作用则可以降低细胞内ROS水平[11]，保护癌细胞免受ROS损伤。Zang等[12]研究发现，莪术醇作用于胃癌GC MGC-803细胞后ROS水平升高，MMP水平降低，IDH1水平下调，细胞增殖受到抑制，细胞周期被阻滞于G2/M期。

PI3K/Akt通路是IGF-1R最重要的下游信号通路之一，可诱导细胞有丝分裂、细胞生长、转化、迁移、存活和抗凋亡等多种作用[13]，GSK-3β是PI3K/Akt通路的重要下游分子，通过激活Akt使其ser9磷酸化而失去功能[14]。因此，它的磷酸化与肿瘤细胞的生物学恶性行为有关。因此，抑制PI3K/Akt通路和p-GSK-3β可能是癌症干预中重要的肿瘤抑制机制。

Li等[15]发现，莪术醇以剂量和时间依赖性的方式抑制IGF-1R和p-Akt的表达，并调控其下游 GSK-3β在鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）CNE-2细胞中的活性，进而引发周期蛋白分 子（Cyclin D1，Cyclin E，CDK2，CDK4，p21和p27）和凋亡相关分子（Bcl-2、Bax和p53以及MDM2、p53、Bcl-2、Bax和cleaved PARP）表达的改变，使细胞阻滞在G0/G1期并发生凋亡。该作用可部分被IGF-1R激动剂IGF-1逆转。以上提示：莪术醇通过抑制IGF-1R/PI3K/Akt/GSK-3β通路的激活，调节其下游周期和凋亡相关分子抑制CNE-2细胞的生长。

1.2 莪术醇抑制侵袭和转移

PI3K-AKT、MAPK、WNT、WNT /b-catenin和其他与癌细胞增殖、侵袭和转移相关的通路在肿瘤的发生和进展中扮演着重要角色[16-17]。越来越多的研究发现来自植物提取物的天然药物化合物在治疗人类疾病方面起着重要作用。靶向天然产物治疗转移性肿瘤是一种有效的治疗方法。Li等[18]研究发现，莪术醇通过调控多种肿瘤相关信号分子如增殖（p-AKT↓、p-PI3K↓、 p-LRP5/6↓、 AXIN↑、APC↑、GSK3b↑和p-b-catenin↓）、迁移和侵袭（MMP-2↓和MMP-9↓）、凋亡（Bax↑、Bcl-2↓、caspase 3↑和caspase 9↑）和细胞周期（cyclin D1↓、CDK1↓和CDK4↓）来抑制体外肺腺癌A549和H460细胞的增殖和转移，从而促进细胞凋亡，与体内实验结果一致。Cai等[19]发现，莪术醇联合塞来昔布作用可抑制NF-κB转录活性，激活caspase-9/caspase-3，阻滞细胞周期在G1期，抑制MAPK、PI3K/AKT信号通路激活和FAK、MMP-9的活性，从而抑制NSCLC细胞（A549、H1299）增殖、侵袭、迁移和细胞周期进程，诱导凋亡并降低小鼠体内肿瘤体积和重量，减少肺组织肿瘤转移结节。

细胞外基质的蛋白水解是肿瘤转移的必要步骤。蛋白水解酶如MMPs的表达和活性的增加有助于肿瘤细胞侵入血流或淋巴系统并扩散到其他器官[20]。Ning等[21]进行体外实验发现莪术醇可以抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞中JNK1/2的磷酸化和Akt的磷酸化，并抑制NF-κB p65的核转位和转录活性，而该抑制作用可被JNK特异性抑制剂（SP600125）和Akt特异性抑制剂（LY294002）增强。进一步研究发现，SP600125、LY294002 和 NF-κB （PDTC）特异性抑制剂可显著增强莪术醇对MMP-9和MDAMB-231细胞迁移、侵袭和粘附的抑制作用。体内实验发现莪术醇可降低NF-κB p65蛋白在db/db小鼠中的表达。以上提示莪术醇对乳腺癌细胞的抗转移作用可能与通过JNK1/2和akt依赖的NF-κB通路抑制MMP-9有关，但尚不清楚莪术醇抑制JNK1/2和Akt的上游途径是什么。

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Skp2是一种F-box蛋白和E3泛素连接酶，调节许多关键的细胞过程，其过表达与肿瘤的转移相关[22]。Li等[23]研究表明，莪术醇可以在mRNA和蛋白水平上抑制Skp2，并促进YAP1的磷酸化，降低YAP1蛋白的表达，破坏YAP1和TEAD 4在Skp2启动子上的结合，抑制TNBC IV2-1细胞抗脱落凋亡，从而影响转移性TNBC细胞的存活。

1.3 抑制肿瘤细胞耐药

肿瘤细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的耐药性一直是临床肿瘤治疗的关键障碍。据报道，NQO2可能通过醌代谢过程中产生的ROS参与癌症启动和进展的各种过程[24]。Jing等[25]研究发现，NRH：醌氧化还原酶2 （NQO2）为莪术醇的关键靶点，与非小细胞肺癌（NSCLC）细胞总生存率呈负相关，敲除NQO2可以在体内和体外抑制NSCLC细胞生长。莪术醇直接靶向NQO2以引起ROS的生成，从而触发内质网应激c /EBP同源蛋白（CHOP）死亡受体（DR5）信号，使NSCLC细胞对TRAIL诱导的凋亡敏感。NQO2中的Phe178是莪术醇结合的关键位点。Phe178突变完全破坏了NQO2的功能，增强了TRAIL的致敏作用。而莪术醇对NQO2的激活是否能与其他倍半萜类化合物共享，从而获得更高的活性和更好的选择性还有待进一步研究。

1.4 莪术醇靶向特定蛋白抑制肿瘤进展[20]

核仁蛋白（nucleolin，NCL）是一种多功能磷酸蛋白，异常表达可通过不同的细胞途径影响癌变、细胞存活、增殖、血管生成、浸润和转移[26]。Wang等[27]鉴定了NCL是NPC细胞（CNE-2）的新型直接靶蛋白，以-7.8kcal/mol的结合自由能与NCL结合，使NPC细胞的NCL发生降解，从而参与莪术醇在NPC细胞中的抗癌作用。敲除NCL后可明显逆转莪术醇对CNE-2细胞的增殖抑制作用。

1.5 阻滞细胞周期进展

CDKL3是一种周期无关的激酶相关分子，与cdc2相关激酶的一个子集密切相关。Zhang等[28]发现，莪术醇通过下调CDKL3的表达来阻断胆管癌（cholangiocarcinoma，CCA）细胞RBE周期从G0/G1期到S期的进程，诱导凋亡，cyclinD1和CDK4的减少以及P21和P27表达的增加支持该结论。

1.6 诱导细胞自噬

自噬和凋亡之间的关系是复杂的。根据不同的细胞类型和刺激的作用，自噬参与促进或抑制癌细胞死亡。Zhang等[17]研究发现，莪术醇处理MG-63细胞后，可观察到cleaved caspase-3积累，胰酶抑制剂Z-V AD-FMK预孵育可降低莪术醇诱导的细胞凋亡，表明莪术醇可诱导caspase依赖性细胞凋亡。经氯喹（CQ）预处理，63.5 mg·L-1莪术醇孵育后，cleaved caspase-3水平降低，LC3I/LC3II表达水平升高，表明莪术醇可激活细胞自噬。另外，p-JNK蛋白表达水平也呈时间依赖性上调，JNK抑制剂SP600125预处理可抑制JNK信号通路的磷酸化和LC3-II的积累。提示莪术醇诱导的自噬涉及JNK信号通路。以上结果提示莪术醇通过JNK信号通路抑制自噬减弱莪术醇诱导的MG-63人骨肉瘤细胞凋亡。

2 表观遗传修饰调控肿瘤的进展

表观遗传修饰已经成为肿瘤发生的驱动因素[29]。异常的DNA甲基化和组蛋白去乙酰化是表观遗传现象中的两大主要因素，已被许多研究证实与肿瘤的发生有关。DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）作为关键酶，在表观遗传治疗中被公认为抗肿瘤药物靶点[30]。肿瘤干细胞在肿瘤的发生、发展、复发和转移中起着至关重要的作用。Peng等[31]研究表明，莪术醇治疗的绒毛膜癌干细胞样细胞（choriocarcinoma cancer stemlike cells，CSLCs）在体外和体内研究中均观察到干细胞抑制。体外表现在莪术醇可通过抑制在CSLCs中高表达的DNMT-和HDAC介导的表观遗传调控来降低绒毛膜癌CSLCs的自我更新。与5-AzaC或TSA联用则显著增强了对CSLCs表型的抑制作用。体内每天口服莪术醇200 mg·kg-1，连续10 d，停药2周后，可观察到相较于DMSO组，莪术醇治疗组荷瘤裸鼠肿瘤体积显著缩小，且存活时间更长。

Ning等[32]发现，c-MET是miR-152-3p的靶基因，莪术醇通过提高miR-152-3p水平来降低c-MET、PI3K、p-AKT和ERK磷酸化水平并抑制NF-κb活性，从而驱动与小鼠黑色素瘤B16细胞死亡相关的c-MET/PI3K/AKT依赖和ERK/NF-κb依赖的通路，这种抑制作用可被miR-152-3p抑制剂逆转，这些结果表明，莪术醇通过上调miR-152-3p水平并促进miR-152-3p结合c-MET，至少部分抑制了黑色素瘤细胞的生长和转移。

Yu等[33]报导莪术醇处理CRC细胞后，miR-30a-5p的表达上调，抑制了CRC细胞的侵袭、迁移和MMP2表达，激活了Hippo信号通路，并增强莪术醇对其下游因子MST - 1、LATS1和YAP1的作用。而miR-30a-5p下调则抑制了Hippo信号通路的激活，逆转对CRC细胞的影响。这些结果表明miR-30a-5p可作为CRC治疗的治疗靶点，这可能与Hippo信号通路的激活有关。

3 调节线粒体凋亡

组蛋白甲基化转移酶2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）在肿瘤的发生、转移和侵袭中发挥重要作用。靶向EZH2被认为是一种治疗癌症的策略[34]。Zhou等[35]发现，沉默EZH2可增强莪术醇对膀胱癌细胞的生长抑制和细胞凋亡作用，减少ROS生成和MMP损失。反之，强化EZH2表达可改善这些效应。进一步研究发现，EZH2增加莪术醇暴露后EJ和T24细胞中Bcl-2和H3K27me3的积累，降低了Bax、Bak和细胞色素c的表达，以上结果表明莪术醇通过靶向ezh2依赖的线粒体凋亡途径抑制膀胱癌细胞增殖。

Zhang等[36]发现，莪术醇作用于人肺腺癌ASTC-a-1细胞后，诱导Bax在6 h内从细胞质快速转位到线粒体，导致线粒体膜电位（Δψm）快速消散，表明线粒体在莪术醇诱导的细胞凋亡中起重要作用。而广谱Caspases抑制剂Z-VAD-fmk没有减弱莪术醇诱导的细胞毒性，说明Caspases不参与莪术醇诱导的细胞凋亡。进一步监测稳定表达FRET质粒SCAT3的活细胞内Caspase-3的激活情况证实了这一结论。以上结果提示莪术醇通过不依赖于Caspase的线粒体途径诱导人肺腺癌ASTC-a-1细胞凋亡。

4 其他

Meng等[37]设计了一系列的莪术醇衍生物，发现莪术醇及其合成的化合物1a-1h和3a-3j对CRC细胞SW620和HCT116具有一定的抗癌活性。其中，除化合物1a、1c、1e、1g、3d、3g外，大多数化合物在浓度为50 μM时对SW620细胞生长的抑制率＞50%。芳基三唑莪术醇衍生物的抑制活性优于化合物1a-1h。其中苯环上带有氟官能团的化合物3e、3i和3j表现出较强的细胞毒性，ic50值分别为（12.46±0.75l）M、（13.57±0.29l）M 和（8.10±0.13l）M，对SW620细胞的杀伤能力是莪术醇的10倍。进一步研究发现，3j呈剂量依赖性诱导SW620细胞凋亡，不诱导细胞周期阻滞。魏永鸽等[38]发现，莪术醇纳米结构脂质载体（20 mg·kg-1、15 mg·kg-1）对乳腺癌细胞MCF-7 移植瘤的抑瘤率为 44. 12%和35.29%，优于20 mg ·kg-1莪术醇27. 94%的抑制率。以上提示莪术醇的新型化合物具有很好的开发前景。

5 总结与展望

目前临床上使用的抗癌药物均有一定的疗效，但是这些药物使用之后所带来的不良反应和副作用严重限制了临床用药。中医药治疗肿瘤历史悠久，副作用小，不良反应少，疗效显著。随着研究的深入，中医药多靶点、多层次、多环节的优点正在被挖掘。莪术醇作为莪术的主要药理成分之一，具有高效低毒的优点：1）莪术醇在体内外均可选择性抑制肿瘤细胞的进展。2）莪术醇不仅通过调节如Bcl-2家族蛋白、Caspase信号通路、PI3K-AKT、MAPK、WNT、WNT /b-catenin、c-MET/PI3K/AKT、ERK/NF-κb等信号通路抑制肿瘤细胞增殖，诱使肿瘤细胞凋亡，也从表观遗传学角度调控癌症基因表达以及通过研发新型衍生物和纳米结构脂质载体等方式抑制肿瘤的发生发展。

虽然对莪术醇治疗恶性肿瘤的机制研究越来越多，但依然有许多问题需要我们继续研究探索和完善相关机制，为其能够早日研发成为新型抗癌药物提供证据。另外，莪术醇新型衍生物和纳米脂质载体能够大大提高莪术醇杀死肿瘤细胞的能力，但目前仍无相关临床应用研究报道证实该药是否有效。因此，无论是单独使用还是与现有抗癌药物联合使用，临床前和临床试验仍需继续研究以阐明其抗癌作用。