猪体外胚胎生产关键技术的发展现状

周国权 黄承俊

（辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳 110032）

体外胚胎生产技术是家畜繁育的核心技术之一。但猪育种中利用该技术的效果不如牛、羊育种,一是因为体外胚胎生产技术常与细管冻精技术相结合,而猪体外胚胎的超低温冷冻难度较大,进展较为缓慢[1]。猪的鲜精液在低温下具有较长的受精保存期[2,3],能够满足国内任意长距离运输的需要。而细管冻精不仅各指标都不如鲜精液[4,5],而且在人工授精前还需要解冻并稀释到一定的精液量[6],推广难度大。二是因为猪为多胎动物,具有高繁特性。我国多数品种的猪平均窝产仔数都在10头以上,有些地方品种猪的产仔数甚至达到几十头的水平[7],这都是体外胚胎移植难以达到的高度[8],也是猪体外胚胎生产难以发挥优势的主要原因。此外,体外胚胎生产不仅需要一定的条件和造价,还难以保证移植后仔猪的品质与数量,综合成本或不低于直接购买。

随着我国对种质资源普查与保护的推进,作为家畜资源保护与利用的重要技术手段之一,猪体外胚胎生产技术体系的应用也逐渐被重视起来,且已运用于某些地方品种猪的保护与开发中[9]。此外,我国猪冻精的生产也取得了很大突破[10,11],在一定程度上促进了猪体外胚胎生产体系的成熟。本文从猪卵母细胞的体外成熟、体外受精和胚胎的体外培养等3方面对我国猪体外胚胎生产关键技术的发展现状进行综述,以期为相关学者提供参考。

1 猪卵母细胞的体外成熟

卵母细胞的体外成熟是体外胚胎生产体系中相对较为成熟和简单的技术环节。卵母细胞除了用于体外胚胎的生产外,还广泛用于克隆胚胎、单精注射胚胎和孤雌激活胚胎的研究。尤其猪等多胎类家畜,由于体外胚胎在生产实践中应用相对较少,该技术环节更偏向于研究领域。

1.1 卵巢的运输条件及卵母细胞的获取

卵巢是卵母细胞的发育储存库,保护好卵巢即是保护好卵母细胞。卵母细胞的保存条件并不十分严格,如距离较近时,可以直接采集并短时间常温保存,然后带回实验室进行处理即可[12,13]。距离稍远时可用含青链霉素的30～37℃的生理盐水先保存,于1～2 h带回实验室进行处理[14,15],且最好不超过6 h。距离再远就需低温保存,此外,也有用其他温度生理盐水保存运输的[16,17]。一般卵巢离体后,运回实验室的时间越短越好。卵巢的保存温度和运输时间因实验室而异,并无严格的数值限定。

卵巢运回实验室后,多数是先去除周围多余的组织,然后用含青链霉素的37℃左右的生理盐水洗3～4次,最后进行卵母细胞的采集操作。由于猪卵母细胞的采集多采用集中捡卵法,可以无需采卵液,因此,有的实验室则不经清洗直接进行采卵。方法主要为抽吸法,方便快捷。常用18号针头的10 mL注射器,对表面直径为3～8 mm的卵泡进行侧吸,然后集中捡卵。

用于体外成熟的卵子一般为具有3层及以上卵丘细胞的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)。这与其他家畜类似,因为裸卵(DOs)的成熟率、受精率和囊胚发育率均极显著低于COCs[18]。捡出的COCs用成熟液洗涤后即可进行成熟培养,一般洗涤次数为3次。

1.2 卵母细胞的体外成熟

常用于猪卵母细胞体外成熟的基础培养液有TCM199和NCSU-23,其中NCSU-23基础培养液是猪卵母细胞体外成熟液的专用基础培养液,效果较好[19]。但也有试验显示NCSU-23不如改良后的TCM199或无差异[20,21],加上TCM199市场化较为成熟,因此,国内研究以使用TCM199基础培养液的较多。成熟培养液在基础培养液上常添加10%胎牛血清(FBS)、10 IU/mL促卵泡素(FSH)、10 IU/mL促黄体素(LH)、0.6/0.57 mmol/LL-半胱氨酸等,或用10%猪卵泡液代替10%FBS,用10 IU/mL孕马血清促性腺激素(PMSG)、10 IU/mL人绒毛膜促性腺激素(hCG)代替10 IU/mL FSH和10 IU/mL LH,有条件的还可加上10 ng/mL表皮生长因子(EGF)及其他改良因子等。培养条件基本都是38.5～39℃、饱和湿度、5%二氧化碳培养箱中培养42～44 h。也有培养46～48 h,甚至更长的,但据贾佩[22]报道培养时间较长其卵裂率和囊胚率均显著低于40～42 h。一般而言,猪卵母细胞的体外成熟时间应不低于40 h,但也不能太长,否则会增加染色体的异常率。

2 猪成熟卵母细胞的体外受精

体外受精技术主要用于体外胚胎的生产。因其可对精子质量进行直接的检验,也常用于各种精子稀释液、冷冻保存液、种公畜精液等的品质检测。由于猪的多胎特性及猪体外胚胎移植产仔率显著低于人工授精的现状,使得体外胚胎生产在猪的应用推广上难度较大。因此该技术环节常见于实验室研究、检验及少量的良种保护,在科研中常被孤雌激活技术所替代。

2.1 精子的洗涤

精子的洗涤是为获能做准备,同时去除杂质,筛选出活力较强的有效精子。精子获能是体外受精的必备前提,获能的好坏直接关系到体外受精成功与否。因此,精子的洗涤环节十分重要。但对于某些特殊对象或试验研究,精子的获能环节可被单精注射等辅助生殖技术所替代,而精子则仍需进行洗涤。

猪精子的洗涤方法与其他家畜的一样,有上浮法、直接洗涤法和Percoll密度梯度离心法。运用上浮法时,上浮1 h最有利于受精胚胎的发育,且受精卵的卵裂率和囊胚率均表现最高[22]。运用Percoll密度梯度离心法时,精子获能时间在20～40 min较为理想[23]。精子洗涤方法的选择因人和实验室条件而异,各有优缺点。

洗涤后的精子需对浓度进行调试,以供受精使用。猪体外受精用精子的浓度一般为105～106个/mL。兰宗宝[24]对0.25×106～8×106个/mL猪精子浓度的体外受精情况做了对比,结果显示,精子浓度为1×106个/mL时囊胚率表现最高,但该区间的卵裂率和囊胚率均无显著性差异。

2.2 猪卵母细胞的体外受精

可用于猪卵母细胞的体外受精溶液有多种,如mTCM199、mTALP、BO液、PGM、mTBM等。其中mTBM因具有较好的受精效果而被各实验室广泛采用[25]。受精前,常添加200 ug/mL的肝素以保证精子的充分获能。或添加一定量的牛血清白蛋白(BSA)、BSA+咖啡因等获能因子来促进精子的获能。其受精时间为6 h,受精条件为38.5～39℃、饱和湿度、5%二氧化碳培养箱,受精方式为微滴法。体外受精液的选择因人、实验室条件和试验用途而异,但不管使用哪一种,其卵裂率和囊胚率均显著低于孤雌激活胚。这可能与猪的体外受精多精入卵率相对较高(可达80%)[26]和受精后雄原核形成率相对较低等因素有关。

3 猪胚胎的体外培养

体外培养技术主要用于受精卵、孤雌激活胚、克隆胚、类囊胚等可发育、短暂发育胚胎、类胚胎的体外发育,以生产融合胚、桑囊胚及相关研究。该技术环节相对简单,主要在于培养液的选用和优化。

可用于猪胚胎体外培养的培养基有NCSU-23、NCSU-37、PZM[27]等。但相比之下NCSU-23更有利于猪受精卵的体外发育,其使用时常添加0.4%的BSA,也可添加其他因子或在培养第5 d后添加10%FBS(或FCS、或PFF)以促进囊胚的发育[28],不可使用猪血清。有试验显示,PZM-3的卵裂率和囊胚率与NCSU-23的差异不明显,有时还略优,囊胚细胞总数和内细胞团占囊胚细胞总数的比例均显著高于NCSU-23[29]。因此,在国内,猪胚胎的体外培养多选用以上2种培养液,一般PZM-3更适合于猪孤雌激活胚胎和克隆胚胎的培养。

猪胚胎的体外发育会遇到阻滞现象,常发生在4-细胞阶段。除上述培养液外,细胞共培养系统也能支持猪受精卵的进一步发育。Nagai等[30]试验发现,猪2-细胞胚胎与猪输卵管上皮细胞或猪胚原代成纤维细胞共培养时,囊胚率能分别达到67%和61%。此外,颗粒细胞单层亦能有效提高猪体外受精卵的囊胚发育率[31,32]。但该技术在国内运用的很少,一方面可能猪的试验材料相对较为丰富,而运用于胚胎移植的需求相对较少。另一方面可能猪的孤雌激活囊胚率相对较高,程序简单且稳定,干扰因素少,较卵母细胞的体外受精和胚胎的体外培养更具试验优势。

猪胚胎的体外培养条件与其他家畜的一样,也是38.5～39℃、饱和湿度、5%二氧化碳培养箱。培养方式为微滴法。观察时间也基本相同,即48 h后检查卵裂情况,7 d后检查桑囊胚的发育情况。

4 结论

猪的体外胚胎生产各关键技术因其多产多胎的特性受到影响,虽然该技术体系在国内已十分成熟,但用途仍集中在试验研究方面,目前以卵母细胞的体外成熟—孤雌激活—胚胎的体外培养线路为主流。随着我国种质资源普查与保护的推进,猪体外胚胎保种势必列入各省地方猪品种保护与利用的关键技术之中,应用也将更倾向于生产。本文讨论了猪体外胚胎生产各关键环节技术的发展现状,将有助于各地方猪体外胚胎保种体系的建立。