环状RNA在慢性阻塞性肺疾病中生物学作用的研究进展

张瑶，刘学军

(1 山西医科大学第一临床医学院,太原 030000 ;2山西医科大学第一医院老年病科,太原 030000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)以持续呼吸道症状和气流受限为特征，是一种大量暴露于有害颗粒或气体的异质性疾病，并受到包括异常肺发育在内的宿主因素的影响[1]。中国成人肺部健康(the China Pulmonary Health，CPH)研究发现，在≥40岁的中国成年人中，COPD患病率为13.7%，与10年前相比上升了55%[2]。COPD发病机制复杂，与氧化应激、炎症、α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，A1AT)和胰蛋白酶失衡及表观基因等有关。尽管有大量研究关注COPD，但有关环状RNA与其发病机制之间关系的研究并不多见。目前环状RNA(circular RNA, circRNA)与呼吸系统疾病关系成为研究热点。 circRNA已被证明与各种呼吸系统疾病密切相关，包括肺癌、急性呼吸窘迫综合征、肺动脉高压、肺结核和矽肺等。作为具有潜在调节功能的RNA家族的新成员， circRNA已引起人们越来越多的关注，几种 circRNA已被鉴定为肺癌、肺动脉高压和肺结核的临床生物标志物[3]，但目前对circRNA与COPD发病之间关系研究仍处于初级阶段。因此，研究circRNA与COPD发病机制关系意义重大。本文对circRNA与COPD的研究做一综述总结，提供circRNA与COPD发病机制的最新研究进展，以期对COPD的预防、诊断、治疗及预后评估提供参考。

1 circRNA概述

1.1 circRNA的发现及形成

circRNA最初在植物类病毒中被发现，当时被认为是剪切出错而产生的无功能产物[4,5]，后来随着技术进步，人们发现 circRNA存在于各种生物体中，并参与生物体的代谢调节功能，且在多种系统疾病中发挥重要作用。circRNA可以以不同的方式起源[6,7]，其形成机制包括外显子circRNA(E circRNA)机制、内含子circRNA(CiRNA)机制和外显子-内含子circRNA(EIciRNA)机制[8-10]，其中外显子circRNA有“直接回拼接”模式和“外显子跳跃”模式[10-11]。直接回拼接模式是指在直接反向剪接模型中，反向剪接首先发生，两个内含子与互补基序配对，并将5′剪接供体和3′剪接受体拼接以直接生成E circRNA。外显子跳跃模型是典型的剪接首先发生，外显子跳跃发生在前体mRNA(pre-mRNA)中，形成包含外显子的套索，通过规范剪接在套索之前和之后对外显子进行剪接，导致形成成熟的线性RNA，然后将切下的套索进行回剪，以生成E circRNA。在E circRNA的生物发生过程中，内含子可能不会被完全剪除，但会保留在新生成的circRNA中环绕的外显子之间。形成的环状结构使其稳定存在于生物体中，并发挥生物学功能。

1.2 circRNA特征及生物学功能

circRNA作为一类新型非编码RNA，其特征是由于3′至5′末端连接(反向剪接)的独特结构产生的共价闭环结构，该闭环结构使得 circRNA对RNA核酸外切酶高度耐受，因此可稳定存在于各种生物体内，可通过调节转录、microRNA(miRNA)的功能及蛋白质来调节基因表达，具有高度保守、稳定性强、特异性高、含量相对丰富的特点。circRNA在多种疾病发生发展过程中起着重要作用，主要通过以下方式发挥生物学功能。

1.2.1 充当miRNA海绵体 circRNA是一种竞争性内源性RNA(ceRNA)[12]，可以充当miRNA海绵体，通过miRNA反应元件降低miRNA的表达水平，并进一步调节下游mRNA的表达，从而起到调节RNA的作用，因此具有许多miRNA结合位点的 circRNA可以充当miRNA海绵体。Sebastian等[13]研究发现小脑变性相关蛋白1反义转录物(circRNA ciRS-7 / CDR1as)具有70多个常规miRNA-7结合位点，与miRNA-7相互作用可作为miRNA功能抑制剂。同样，Hansen等[14]证实小鼠睾丸特异性circRNA(Sry circRNA)可与miRNA-138相互作用起到海绵体的作用。且 circRNA作为海绵体似乎比其他竞争性内源性RNA更强，由此可见circRNA通过与miRNA相互作用，从而调节RNA达到生物功能。

1.2.2 参与竞争性剪切与转录 circRNA不仅可以作为miRNA海绵体发挥作用，还可以通过竞争线性剪切起到改变基因的作用。Ashwal-Fluss等[15]发现circRNA通常由剪接体产生，产生速率取决于侧翼内含子，而环化速率与包围外显子剪切位点存在有关，且内含子序列可能降低侧翼外显子的线性剪接效率，且某些基因剪切效率与circRNA水平呈负相关，由此可见，circRNA的产生可调节线性剪切过程。不仅如此，Li等[16]发现与RNA聚合酶Ⅱ相关的circEIF3J和circPAIP2，主要位于细胞核中，可与U1 snRNP相互作用并促进其亲本基因的转录，因此circRNA可作为转录及剪切的调节因子。

1.2.3 参与蛋白质翻译 Chen等[17]发现真核生物核糖体能够在合成的 circRNA上启动体外翻译。为验证circRNA是否可以充当指导蛋白质合成的mRNA，王洋等[18]在circRNA中通过Western blot检测了潜在的蛋白质生成，在含有结构内含子或非结构内含子的基因中发现了蛋白质生产，表明circRNA确实可以作为mRNA来指导蛋白质合成。Yang等[19]发现circRNA被N6-甲基腺苷广泛翻译，且数百种内源性circRNA具有翻译潜力。大多数研究也发现多数circRNA可以转运到细胞质中，进一步证实circRNA可以充当翻译蛋白质的mRNA。

1.2.4 参与抑制细胞周期 circRNA可以充当诱饵从而抑制细胞周期。Du等[20]通过用circ-Foxo3表达构建体，发现环状RNAcirc-Foxo3的表达不仅可直接抑制细胞增殖和细胞周期进程，使得更多细胞被阻滞在G1期，还可以与其他与细胞周期相关的蛋白质相互作用，包括CDK6、p16和p27，从而抑制细胞周期。除此之外，circ-Foxo3可以与p21及CDK2结合形成circ-Foxo3-p21-CDK2三元复合物，该复合物会阻止CDK2与细胞周期蛋白E相互作用，并进一步影响细胞周期蛋白A、E之间结合，从而抑制细胞周期。circRNA还有更多生物学功能，如其衍生假基因的环状RNA circRFWD2，可以被逆转录并重新插入宿主基因组，从而改变基因组结构。

2 circRNA与COPD

2.1 circRNA与香烟烟雾

众所周知，香烟烟雾是COPD的危险因素。香烟烟雾包含尼古丁、一氧化氮、氧化剂等4 500种成分，会对肺泡毛细血管屏障的通透性产生影响并且使肺组织产生炎症。最近有研究指出香烟烟雾会通过影响气道上皮细胞的circRNA发生一系列反应，从而导致COPD产生。Zeng等[21]通过对人气道上皮模拟吸烟组及对照组行circRNA的测定，发现吸烟组中的 circRNA表达量少于对照组，这表明香烟烟雾显著降低了 circRNA的生物发生，且在吸烟组中，hsa-circ-0061052，hg38-circ-0011916和hg38-circ-0002169显著上调，hsa-circ-0006892，hsa-circ-0006794和hsa-circ-0008725显著下调，这些失调的circRNA可能参与了COPD患者小气道上皮细胞功能障碍的发展；该研究还发现circRNA可以与miRNA相互作用，从而影响磷酸戊糖途径、ATP结合盒(ABC)转运蛋白、糖胺聚糖生物合成途径和其他途径所需的许多基因的表达，表明circRNA介导的转录后调控可能是通过气道上皮细胞中的miRNA参与了COPD的过程。气道上皮中的miRNA在COPD中机制与核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)[10，11]通路相关。核转录因子(RelB)是NF-κB 家族中的一员，RelB通过miRNA-146a调节COX-2表达，吸烟将增加RelB稳定表达的细胞中miRNA-146a的表达，通过调节COX-2来促进炎症的表达。因此，香烟烟雾可能使气道上皮细胞中某种circRNA增加，通过与细胞中的miRNA相互作用增加miRNA-146a表达，使核转录因子通路增加而产生大量COX-2，从而促进炎症产生。Ma等[22]也通过对小鼠荧光标记发现长期香烟烟雾会引起circRNA 0061052水平升高、miR-515-5p水平降低以及肺组织中的上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)降低，从而导致肺功能障碍和气道阻塞。Xue等[23]研究发现COPD中hsa-circ-0006872水平升高，与miR-145-5p水平呈负相关，hsa-circ-0006872沉默可通过调节miR-145-5p抑制香烟烟雾诱导的细胞损伤，而香烟烟雾正是通过hsa-circ-0006872/miR-145-5p轴促进了NF-κB途径的激活。以上研究都提示香烟烟雾可影响细胞中某种circRNA的表达水平，不同的circRNA通过不同机制促进炎症、诱导细胞损伤、导致气道阻塞等，从而影响COPD发生及发展。

2.2 circRNA与细颗粒物

细颗粒物(particulate matter 2.5 μm, PM2.5)是环境污染重要组成部分之一，可通过氧化应激、炎症反应和免疫功能失衡影响COPD的进展。Li等[24]通过研究PM2.5在正常小鼠与COPD小鼠中circRNA的表达，发现暴露于PM2.5后环状RNA circBbs9表达上调，而在COPD模型小鼠中组织circBbs9表达更为显著，并证实circBbs9的上调促进了炎症反应和NLRP3炎症小体的活化，还发现circBbs9不仅可与miR-30e-5p结合通过减轻腺苷脱氨酶的降解激活NLRP3炎症小体及增加炎症细胞因子表达，也可以直接参与NLRP3炎症小体相关基因的表达。NLRP3炎症小体作为固有免疫重要组成部分在疾病发展过程中起重要作用，其激活会进一步导致caspase-1激活，caspase-1主要负责白介素前体的活化，可将白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)转变成它们的成熟形式。IL-1β和IL-18属于促炎细胞因子白介素1家族，它们是肺部炎症和损伤的主要调节剂，在COPD发病中起着重要作用。可见暴露于PM2.5后circRNA会增加炎症小体及炎症细胞因子的表达，从而产生肺部炎症并促进COPD的发生。Zhou等[25]的研究发现PM2.5加剧了暴露于香烟烟雾的人支气管上皮细胞的凋亡,此类凋亡可被miRNA-194-3p过表达所抑制，这表明miRNA-194-3p可能是COPD保护性miRNA和潜在的治疗靶标，而如果circRNA与miRNA-194竞争性抑制,减少miRNA-194-3p对炎症的抑制作用，则可能促进COPD的发生发展。

2.3 circRNA与免疫失衡

随着研究不断深入，已证明COPD的发病与免疫失衡有关[26]。Duan等[27]通过比较稳定期COPD与正常人中miRNA与circRNA中的差异，发现上调的miRNA主要涉及免疫反应、细胞死亡和凋亡、炎症因子激活和信号转导，下调的miRNA与抗原加工和呈递、T细胞受体信号传导途径、T细胞活化、RNA剪接和miRNA稳定性以及炎症信号传导途径的负调控有关。为了构建circRNA靶途径网络，选取自然杀伤细胞介导的细胞毒性途径、Th17细胞分化途径及和核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体(NLR)信号传导途径，上述3个途径涉及65个circRNA：30个 circRNA靶向自然杀伤细胞介导的细胞毒性途径，20个靶向Th17细胞分化途径，35个靶向NOD样受体信号通路，且hsa-circRNA-0008672是这3个途径的核心。无论是上调的miRNA还是下调的miRNA，皆与免疫及炎症反应有关，这些失调的circRNA可能通过影响这些途径来促进COPD的发展。此外，有研究发现重度COPD会抑制人自然杀伤细胞的细胞毒性，使肺对呼吸道病原体的抵抗力降低，并导致继发性炎症，反而加速COPD的进展[28]。这些都表明 circRNA和miRNA的失调与COPD的发生有关。不论circRNA是通过作用于miRNA还是直接影响COPD的发生发展，都表明circRNA与COPD之间有千丝万缕的联系。

3 circRNA对COPD的诊断价值

COPD是一种可以预防和治疗的呼吸系统疾病，气流受限程度往往与肺部对有害颗粒或气体的炎症反应密切相关[29，30]。COPD的早发现、早治疗对于预后非常重要，但因其早期无特殊症状，故难以早期诊断。Akbas等[31]通过定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)阵列系统分析了COPD患者中的血清miRNA的水平，发现5个miRNA明显失调，与对照组相比，miR-20a、miR-28-3p、miR-34c-5p和miR-100下调，而miR-7上调，且miR-7可能与COPD的发生有关，提示miRNA-7 可能可以作为诊断 COPD 的潜在分子标志物，正如上文中提到的，circRNA可与miRNA-7相互作用从而抑制miRNA-7的生物学作用。为了研究circRNA作为诊断COPD生物学标志物的价值，Chen等[32]发现circRNA 0001859可能作为治疗COPD和AECOPD的潜在预后和诊断生物标志物，而陈福涛等[33]研究发现COPD患者circRNA001988、circRNA0000344明显下调、circRNA0000284 明显上调，提示circRNA可能在COPD发生发展的某一阶段起作用，可以作为诊断和预后评估的潜在生物标志物。

4 展 望

circRNA在COPD发病机制中的研究仍未完全清楚，目前关于circRNA生物学功能尚处在研究阶段，大多数研究仅使用circRNA微阵列或下一代基因测序来鉴定差异表达的circRNA，以及可能预测这些circRNA的可能参与机制，但这些circRNA功能及具体的发生发展机制尚未得到深入研究，需要进一步探索circRNA与蛋白质及其他非编码RNA相互作用的具体机制，circRNAs作为生物标志物的敏感性和可靠性在不同的呼吸系统疾病中需要更多的临床验证，对于能否成为COPD诊断治疗及预后的新靶点，仍是未来需要不断探索的问题。