基于GSEA 分析FoxM1 表达变化对人肝内胆管细胞癌增殖及侵袭相关信号通路的影响

刘凌云 毛 涵 黄培露 陈书乐

桂林医学院附属医院肝胆胰外科，广西桂林 541001

肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是一种高度恶性胆道肿瘤，预后极差[1-2]，其发病机制涉及基因突变、信号通路失调及表观遗传改变等多个方面[3-4]。深入研究ICC 信号通路的功能及机制，有利于揭示其疾病进展机制。叉头盒蛋白M1（FoxM1）是调节细胞增殖和凋亡的重要转录因子[5]，在多种实体瘤中高表达并可促进肿瘤形成、侵袭和转移[6-7]。笔者前期研究也证实FoxM1 促进ICC 增殖及侵袭[8]，然而，FoxM1 表达变化对ICC 增殖及侵袭相关通路的影响及机制尚未清楚。

基因芯片RNA 数据库数据挖掘是当前研究热点之一。基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）能在RNA 水平层次挖掘影响相关疾病的基因信号通路，从而为具体基础实验提供直接证据[9]。

本研究先通过GSEA 分析寻找ICC 中FoxM1 mRNA 高、低表达组之间可能存在的差异表达基因及相关信号通路，再在前期相关实验已经建立的FoxM1高、低表达ICC 细胞系中[8]验证相关重要信号通路，从而初步证实其是否参与了FoxM1 调控ICC 增殖及侵袭等恶性表型。

1 材料与方法

1.1 数据收集、筛选及GSEA 分析

从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（https：//cancergenome.nih.gov/）数据库下载36 例ICC 患者的mRNA 数据（格式为Htseq-Counts）。通 过gencode（https：//www.gencodegenes.org/）数 据 库的文件将基因ID 注释为基因名。按照总体FoxM1 表达值中位数分为FoxM1 高表达组和低表达组并制作成表型数据文件（cls 格式，分组为FoxM1 high 和FoxM1 low），将mRNA 数据制作成与表型数据相对应的基因表达谱文件（gct 格式，矩阵形式）。随后，使用GSEA（http：//software.broadinstitute.org/gsea/ index.jsp）官网提供的基于JAVA 环境的GSEA 软件（version3.0）分析比较FoxM1 不同表达组之间可能存在的差异表达基因及信号通路[10-11]。在GSEA 分析中使用GSEA官方提供的Molecular Signature Database（MsigDB）作为通路注释源（同时包含KEGG 和REACTOME 等常见通路注释数据）。通过1 000 次循环的排列组合寻找显著富集信号通路。

1.2 Rt-PCR 检测ICC 细胞系中FoxM1 及P53 mRNA的表达

一般材料：人ICC 细胞株HCCC-9810 和SSP-25（均购自中国科学院细胞库）；RPMI1640 培养基（Life Technologies）；胎牛血清（Life Technologies）；LV-FoxM1-RNAi、FoxM1 过表达慢病毒及转染试剂（中国吉凯基因公司）；RT-PCR 使用SYBR（Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase H Plus）（货号：RR820A，日本TaKaRa 公司）；FoxM1 及P53 兔抗人多克隆抗体（Abcam）；GAPDH抗体（北京博奥森生物有限公司）。

方法：慢病毒分别转染HCCC-9810 和SSP-25细胞（按照试剂盒说明书操作，上调FoxM1 为HCCC-9810-FoxM1 组、下调FoxM1 为SSP-25-shFoxM1 组），稳定转染成功后收集HCCC-9810-FoxM1 组、SSP-25-shFoxM1 组和各自对照组对数生长期细胞，Trizol法提取总RNA，按照说明书合成cDNA 及后续操作。使用NCBI 在线Primer Blast 工具设计引物，反应体系中引物序列见表1。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验或单因素方差分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FoxM1 表达对ICC 信号通路影响的GSEA 分析结果

GSEA 分析发现，ICC 中FoxM1 不同表达时常见基因信号通路如P53、MYC 信号通路表达差异均有统计学意义（均FDR-q 值＜0.250）。GSEA 基因信号通路富集分析结果情况见表2，主要有P53、ATM、ATR 和E2F 信号通路等。

2.2 GSEA 分析FoxM1 表达对P53 信号通路的影响

本研究重点选择分析了P53 信号通路的GSEA情况，结果显示FoxM1 高表达时KEGG_P53_SIGNALING_PATHWAY（图1A）和PID_P53_DOWN STREAM_ PATHWAY（图1B）及PID_P53_REGULATION_PATHWAY（图1C）富集值更高，FDR-q值均＜0.250。

2.3 ICC 细胞系中验证FoxM1 表达变化影响P53 信号

RT-PCR 结果显示，慢病毒转染后上调FoxM1 表达的HCCC-9810-FoxM1 细胞组中P53 mRNA 表达较对照组明显升高，而下调FoxM1 表达的SSP-25-shFoxM1 细胞组中P53 mRNA 水平较对照组则显著下降，差异均有统计学意义（P ＜0.0 001）。见图2。

3 讨论

ICC 发生发展伴随多个细胞信号通路的异常改变，包括EGFR、c-MET、WNT 和AKT/PI3K 信号通路等[3]。P53 基因突变是人类肿瘤中最常见的遗传学改变之一[12]，突变后P53 基因由抑癌基因转变为癌基因，P53 介导的信号转导与众多恶性肿瘤发生发展、侵袭及转移相关[13-15]。目前P53 通路在ICC 中作用尚不十分明确，需要进一步探索。

研究发现，FoxM1 调控相关通路在多种实体瘤中发挥重要作用[16-17]。FoxM1 在Ras 信号驱动的HCC 进展过程中起到关键作用[18]。FoxM1 还作为关键的下游效应子，调控MET 信号通路从而导致胃癌细胞DNA损伤[19]。FoxM1 与β-catenin 或SMAD3 作用，分别介导致癌基因WNT 及TGF-β 信号通路激活，从而扮演促癌蛋白的角色[20]。而P53 和FoxM1 之间关系已有相关报道，研究发现P53 介导FoxM1 抑制对维持稳定的细胞G2周期阻滞具有潜在价值，由此认为促增殖FoxM1 是P53 介导抑制的靶标[21]。研究表明，乳腺癌P53 野生型通过抑制FoxM1 转录来抑制MELK 表达，而突变型乳腺癌中MELK 表达明显升高，从而表明突变型P53 通过释放FoxM1 的野生型P53 依赖性抑制来诱导MELK 表达增加[22]。另有研究报道，功能获得性突变体P53 通过靶向FoxM1 促进头颈部鳞癌的致癌潜能[23]。FoxM1 能促进ICC 增殖及侵袭，但FoxM1 如何调控ICC 细胞恶性表型，与ICC 中P53 通路关系如何均不明确，尚需进一步阐明。

本研究首先使用GSEA 分析FoxM1 表达与ICC相关信号通路之间的关系，结果发现，ICC 中FoxM1 高低表达情况下，较多基因信号通路如P53、MYC 信号通路表达有显著差异性，而这些通路与ICC 增殖及侵袭转移等密切相关，提示FoxM1 可能在ICC 发生发展等不同演进阶段产生广泛作用。另外，基于P53 信号在恶性肿瘤中的广泛而重要作用[13,24-25]，本研究重点分析并发现了ICC 中FoxM1 表达变化与P53 信号密切相关。接下来，RT-PCR 证实上调FoxM1 表达则P53 mRNA 表达升高，而下调FoxM1 则P53 mRNA 表达下降，提示FoxM1 高表达可能增强ICC 中P53 信号通路活性，也可以反向推测，可能由于ICC 中P53 基因突变增加，P53 蛋白和mRNA 产物增加、从而P53信号调控FoxM1 表达上升，但其机制尚需进一步探索。ICC 中P53 突变及类型、与FoxM1 相互作用及其上下游机制研究可能是未来具有前景的研究方向。

综上，本研究初步阐明了FoxM1 在ICC 中过表达可明显影响ICC 增殖及侵袭相关信号通路，尤其是P53 通路。结果表明FoxM1 促进ICC 进展可能部分通过P53 信号通路起作用，但具体机制尚需进一步研究。本研究为揭示ICC 发生发展的分子机制提供了一定的理论基础，为进一步佐证FoxM1 成为ICC 新的生物标志物及治疗新靶点提供了新依据。