肠道干细胞衰老机制研究进展及针灸应用思考∗

陈雅男，翁志军，赵 琛，郑寒丹，刘雅楠，李昆珊，陆 嫄，马 喆，崔云华，△

1上海中医药大学，上海 201203；2上海市针灸经络研究所

肠道干细胞（intestinal stem cells，ISCs）是成体干细胞定向分化出的一种具备终生自我更新与分化特性的细胞，位于Lieberkunn’s隐窝中。ISCs分化出的定向祖细胞分为五种：吸收细胞、杯状细胞、内分泌细胞、M细胞、潘氏细胞。前四种都会向肠腔方向迁延，总称为肠道上皮细胞（intestinal epithelial cells，IECs），因ISCs与IECs的生理关系比较紧密，所以经常将这两类细胞一同分析描述。现就近年肠道干细胞衰老机制研究进展及相关针灸研究进行综述。

1 影响肠道干细胞衰老的因素

肠道干细胞作为成体干细胞定向分化出的一种，具有自我更新并特化成为某种组织类型的细胞功能［1］。它在特定条件下，或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，从而使器官和组织的细胞保持生长和衰退的动态平衡。

近年来，关于干细胞衰老的学说相继被提出，其中具有代表性的有程序性衰老理论、自由基衰老学说、端粒损伤理论、DNA损伤学说、线粒体损伤学说、表观遗传修饰学说及热量限制学说（caloric restriction，CR）。有学者［2］认为，生长因子、细胞因子和细胞外基质分子构成了一种供干细胞增殖与分化的微环境，同时分泌各种各样的细胞因子，其产物是随干细胞的衰老而变化的。表明微环境的衰老标志着系统环境的改变，干细胞的微环境在维持干细胞功能和调节衰老方面起着重要作用［3］。所以整个肠道的衰老变化对于研究肠道干细胞的衰老机制具有重要意义。研究［4］显示，相对于年轻小鼠，衰老小鼠的小肠衰老表现在隐窝数量均匀减少，肠绒毛增大且数量减少，同时绒毛微血管结构也有改变。研究［5］发现，潘氏细胞的数量和分泌功能在成年之后随着年龄显著下降。

1.1 线粒体DNA损伤以及副产物对肠道干细胞的影响线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）具有调控细胞合成与凋亡［6］的作用。有学者认为，mtDNA由于被损伤及复制过程产生大量突变，导致氧化磷酸化能力下降，体内供能不足随之发生衰老。哺乳动物的mtDNA通过氧化磷酸化反应（oxidative phosphorylation，OXPHOS）过程产能的同时会有副产物，其中一种就是自由基（reactive oxygen species，ROS），它是损害干细胞DNA完整性和稳定性的重要因素之一。大量研究［7-8］证实它参与了多种疾病的发生，且其与肿瘤和衰老的关系尤为密切。人体接触紫外线和X射线及一些有毒化学物和某些食物都会生成ROS，这些诱因还可导致mtDNA等线粒体基因发生突变，抑制氧化磷酸化反应导致ROS增加，进而损害线粒体功能，促使细胞凋亡。当细胞死亡累积到一定程度时，器官功能衰退就会出现衰老表征［9］。ROS与其他新陈代谢所产生的有害产物都可被超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）清除，同时SOD还可抗阻ROS对细胞的伤害并及时进行修复［10］。反之，衰老机体中SOD清除自由基的能力减弱，也可间接促使细胞衰老［11］。

除了ROS的刺激因素，基因组在复制过程中往往会出现错误，为了纠正这些错误，人体内会产生与DNA损害相适应的细胞应答以修复细胞、减缓老化进程［12］。另外还有研究［13］发现，小鼠干细胞自噬异常可以导致蛋白质稳态丢失，增加线粒体的损伤与氧化压力，使年轻的细胞加速衰老。

线粒体呼吸链（respiratory chain，RC）在线粒体DNA产生ATP的过程中扮演了重要的角色。临床研究发现，在衰老的人体组织内，RC缺陷的干细胞增殖能力降低并增加后代的细胞凋亡率，导致肠隐窝细胞群减少。老年人的小肠干细胞的子代细胞由于呼吸链的缺陷导致增殖减少，凋亡增加［14-15］。

1.2 肠道干细胞衰老过程中端粒、端粒酶的研究观察端粒（tolemere）是真核生物染色体末端的特殊结构，端粒随着年龄增长缩短，这是一种经典的衰老机制。具有活性的端粒酶的存在意义就是延缓端粒长度的缩短速度。研究［16］发现，12个月的端粒酶基因敲除小鼠出现早衰现象，比如肠壁绒毛萎缩，甚至某些区域绒毛和黏膜扁平缩短。Klotho与端粒酶活性和端粒长度有关，可直接影响干细胞的衰老过程，并且认为干细胞功能障碍是由Klotho缺陷和端粒缩短引起的。

1.3 肠道干细胞衰老和表观遗传学说二者的关系表观遗传和干细胞衰老是机体衰老的两个重要因素。表观遗传会通过调节染色质结构和状态进而调节细胞衰老和寿命，影响基因表达。在衰老过程中，表观遗传的改变可导致干细胞损耗［17-18］。而干细胞损耗是导致多种组织发生衰老相关的生理病理学变化的重要原因。因此，表观遗传拥有控制干细胞建立以及维持的功能，所以干细胞的表观遗传失调可导致发生衰老和衰老相关疾病［19］。

1.4 相关信号通路对肠道干细胞衰老的影响“早熟性衰老”是干细胞衰老的一种形式，是指以外界刺激导致干细胞微环境的变化，阻滞干细胞增殖而衰老。这种形式与一些信号通路有密切联系，其中Wnt信号通路在衰老的过程中有重要的调控作用［20］。研究证实，肠上皮细胞增殖的主要动力来源为Wnt通路，衰老时ISCs中Wnt信号传导下降［21］，证实了该因素在衰老进程中的重要性［22］。另有研究表明，ISCs中主要减少的经典Wnt信号传导导致机体衰老过程中ISCs功能衰退及Paneth细胞和间充质中Wnt3表达下调，可能促进衰老肠道干细胞中经典Wnt信号传导活性的降低，继而成为恶性循环［23］。可以推测，通过在老化的肠道干细胞中重新激活经典Wnt信号传导可能是延缓衰老的作用机制之一［24］。

在 近 年 的 研 究［25-27］中 发 现，DNA损 伤 反 应（DNA damage response，DDR）和p53途径［28-29］可能在Wnt/β-catenin信号通路激活导致干细胞的衰老的过程中发挥了重要作用。有学者［30］认为激活的DNA损伤反应可进一步激活p53途径，也研究发现DNA损伤不依赖于p53，而是直接引发衰老［25］。这两者的关联现在还未完全阐明，还需继续研究。

Insulin/IGF-1，简称IIS，是调节机体生命周期的一条通路［31］。研究［32］显示，在秀丽隐杆线虫编码类似insulin/IGF-1的激素受体的基因daf-2可显著延长寿命，不仅如此，影响IIS通路下游成分的突变也能延长寿命。在果蝇肠模型中研究发现抑制其肠道干细胞中的IIS通路可以延长寿命［33］，而机体进入衰老形态后，IIS失活，并且加速引起衰老［32］。当机体处于应激状态时，细胞经常活化JNK信号通路以作为细胞保护应答，JNK的活化可引起干细胞增殖功能增强［34］，然而在此过程中，子代细胞的分化缺陷升高导致肠上皮功能受损［35］，需要限制以确保长寿。干细胞衰老的信号通路还有很多疑问，需要继续研究。

1.5 热量限制对肠道干细胞衰老的影响热量限制在延缓机体衰老以及抵御年龄相关的疾病具有显著效果［36］。其具体机制现有以下说法：禁食之后机体处于低热量状态，延缓年龄相关的细胞组织功能减退，所以认为低热量状态对年龄相关引起的组织功能减退具有抑制作用。有研究显示，通过研究急性脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，FAO）幼鼠和衰老小鼠模型，发现它们的ISCs功能快速提升［37］。有学者［38］认为，FAO会造成丙酮酸氧化降低，这会增强肠道干细胞功能，另一种可能是低热量状态下线粒体衰老与线粒体代谢受损和FAO在许多组织中有关。研究［39］认为，高脂饮食直接影响了ISCs与祖细胞的功能，是通过过氧化物酶体增殖物激活受体δ，也称为PPAR-d，信号传导增强了肠道干细胞功能；表明热量限制可以通过保留抗损伤储备肠道干细胞池的方式增强肠上皮的再生能力［40］。

1.6 p53蛋白及其家族与肠道干细胞的关系p53蛋白是一种抑癌蛋白，与衰老和肿瘤的发生机制有着密切的联系。研究发现，在细胞培养中，端粒功能失调诱导p53依赖性的DNA损伤检查点，包括p21的依赖性衰老［41-42］。研究表明，p53对于衰老端粒功能失调小鼠的肠上皮完整性具有正向调节作用［43］；p53会消耗携带断裂DNA和染色体畸变的肠道干细胞［44］；当DNA损伤至无法修复时，激活的p53上调促进凋亡蛋白表达和线粒体细胞色素C释放并导致细胞凋亡［45］。上述p53介导的DNA损伤信号通路可防止DNA损伤在细胞内的积累，阻止新生癌细胞出现。从该角度而言，p53的肿瘤抑制作用对延长机体生命有重要作用，而高表达p53基因小鼠出现组织干细胞功能下降等各种早衰表型［46］。研究证明，p53诱导的凋亡和衰老可能通过损耗干细胞数目和功能影响老化进程［47］。有学者［48］也在果蝇中研究发现衰老过程中干细胞功能下降的同时增加了老化组织稳态的可能性。另有研究［49］发现，衰老机体中的干细胞中的p53蛋白除了抑制细胞增殖还具有抑制肿瘤因子表达的作用；干细胞中的p53被激活后，其介导的DNA损伤信号通路导致细胞周期出现不可逆的阻滞，引起干细胞的衰老和凋亡［50］。

p21基因与p53属于同一家族，可以通过抑制周期素依赖激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）复合物活性，将调控细胞周期与肿瘤抑制作用联系起来并且在细胞出现适度DNA损伤时发挥修复作用。炎症反应激活p53并介导细胞周期阻滞，激活的p53诱导CDK抑制剂p21基因转录，一般情况下可致细胞衰老［51］。同一家族的P16Ink4a与P19Arf（人类中的p14Arf）在衰老的机体中的表达也有所增加。

2 针灸与肠道干细胞衰老的关系

2.1 针灸延缓肠道干细胞衰老的研究思路《灵枢·九针十二原》篇云：“经脉十二，络脉十五。”《灵枢·本藏》篇曰：“经脉者，所以行血气而营阴阳，濡筋骨，利关节者也。”经络的作用就是运行全身气血、联络脏腑官窍、沟通上下内外。国内一些学者［52］认为经络的巡行走向与干细胞巢的分布有着密切的关系，具体来说不同器官的干细胞巢的分布构成了经络，刺激该脏腑的经络可沿着循行走向到达病处进行修复。

不论在西方医学还是中国传统医学理论中，衰老都是一种整体性的变化，肠道作为重要的消化器官，ISCs作为肠道上皮细胞的生长“基础”，其衰老对于系统的老化进程有着不可忽视的影响。LEI等［53］研究发现，ISCs与肠上皮细胞下肌成纤维细胞有很紧密的联系，主要表现为可以调节局部内环境继而影响肠道干细胞。据这份研究结果可以推测，针灸调节肠道干细胞的影响因子继而间接调节肠道干细胞衰老进程的研究。

2.2 针灸干预信号通路延缓肠道干细胞衰老近年来，针灸在信号通路层面对于机体正向性调节作用的研究较多，前面阐述了肠上皮细胞增殖主要的动力来源是Wnt通路激活，增殖的来源是肠道干细胞，所以肠道干细胞衰老、机体系统性衰老和Wnt信号通路被抑制激活这三者相互影响。JNK通路上调导致干细胞增殖增加的过程中，相关干细胞的子代细胞分化出的缺陷明显增加，可使肠上皮细胞功能受损。前面提到导致衰老是一种协同作用，而同种延缓衰老的干预方式也可能同时在不同的通路中发挥了作用，如果将针灸作为干预ISCs中Wnt信号通路的手段，可能会发现其延缓衰老的作用机制。

2.3 针灸干预衰老肠道炎性环境延缓肠道干细胞衰老有学者［54-55］认为肠道的衰老过程伴随着慢性、低度的炎症状态。因此肠道内环境发生不平衡且持续的损伤，影响机体的衰老；针灸在细胞-体液免疫方面的调节机制主要表现在调整机体的免疫功能，使衰老过程中免疫功能得以趋近于正常［56］。故为针灸延缓衰老提供了依据，这种炎症状态可能对ISCs有一定影响，所以理论上针灸可以延缓肠道的衰老过程。

3 小结

自古以来，延缓衰老都是人类的共同希望，针灸不仅在中国传统医学中具有举足轻重的地位，而且在延缓衰老方面具有独特的优势。近年来有关研究很多，然而已有的研究尚未涉及到肠道干细胞的层面中，当然，已经有越来越多的实验证明一些单独的机制学说之间有着千丝万缕的联系。但是关于针灸干预肠道干细胞衰老的机制研究方面还是空白，所以从该角度入手研究，可能会有新的发现，从而为人类抗衰老、延缓衰老研究进程提供一条途径。