LAMP技术在重症肺炎患者病原体检测中的价值

张 薇 任春平 张文莉

[宁夏中西医结合医院（宁夏第三人民医院）检验科，宁夏 银川，750021]

由于临床肺炎患者增加，准确快速检出肺炎患者的病原菌对临床的诊治至关重要。重症肺炎是临床上常见的危重疾病，其病情发展迅速，常出现休克及多个器官功能障碍，病死率高且预后差[1]。传统病原学检查主要包括痰涂片、痰培养和血清学检查[2-3]。其中痰培养是临床最常用的细菌检测手段，但培养周期较长，细菌培养的阳性率仅为45%～55%[4]。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，以特异性强、敏感度高、操作简便等优点被广泛应用于感染性疾病的诊断。研究显示，LAMP技术可以快速扩增肺部感染患者痰液中的常见致病菌核酸，以细菌浓度1×103为界值，敏感度达74.0%，特异度达95.3%[5-6]。呼吸道病原菌核酸检测（恒温扩增芯片法）在LAMP技术的研究基础上，采用微流控芯片技术和恒温扩增技术，掺入荧光染料进行恒温（65 ℃）反应和实时荧光分析，一步完成对靶基因的扩增和检测，可以同时检测13项主要病原菌[7]。但对于重症肺炎患者检测结果与痰培养的对照研究及影响因素分析，国内鲜有研究报道[8]。本研究通过观察给予重症肺炎患者LAMP技术检测和传统痰培养检测结果的相关性，旨在深入探讨LAMP技术对早期重症肺炎的临床诊断价值和意义，为规范重症肺炎患者早期临床病原微生物检测奠定理论基础。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2020年4月～2022年4月宁夏中西医结合医院收治的重症肺炎患者100例作为研究对象。所有患者均知情同意参与本研究并签署知情同意书，且本研究已被宁夏中西医结合医院医学伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：（1）符合重症肺炎诊断标准，即满足1项主要标准或≥3项次要标准[9]。主要标准：①气管插管需要机械通气；②感染性休克积极体液复苏后仍需要血管活性药物。次要标准：①呼吸频率>30次/min；②氧合指数<250 mm Hg（1 mm Hg≈0.133 kPa）；③多肺叶浸润；④意识障碍和（或）定向障碍；⑤血尿素氮≥7 mmol/L；⑥低血压需要积极的液体复苏。（2）年龄18～90岁。

排除标准：①艾滋病毒感染者；②肺结核者；③痰液标本采集不合格者；④自动出院或死亡者；⑤合并肿瘤患者；⑥妊娠、哺乳期妇女；⑦神经精神障碍者。

1.3 检测方法

所有患者入院后规范化留取痰标本（晨起漱口后留取深咳痰约3～5 mL）立即送检到微生物室，都给予LAMP技术和传统痰培养检测。检测设备：API鉴定板条购自美国Sigma公司，VITEK 2 COMPACT全自动细菌鉴定药敏仪购自美国BD公司，恒温荧光核酸扩增仪购自日本荣研化学株式会社，核酸提取与纯化试剂盒购自德国QIAGEN公司，抗酸染色液购自瑞罗氏公司，BSC-ⅡB2生物安全柜购自国药北京公司。

1.3.1 传统痰培养检测

将采集的痰标本在2 h内分别接种于血平板、巧克力平板、伊红美蓝平板上，置于35 ℃恒温箱中孵育24～48 h，用API鉴定板条或VITEK 2 COMPACT全自动细菌鉴定药敏仪进行鉴定。

1.3.2 LAMP技术检测

采集的痰标本按以下流程处理：①样本处理：根据标本性状加入不同比例10%氢氧化钠溶液（NaOH），充分震荡混匀，于37 ℃液化30 min，以无固态及拉丝状为液化完全；取1 mL液化样本于1.5 mL无菌离心管中，12 000 r/min，离心5 min，弃上清液；加入1 mL洗液，震荡使沉淀完全悬浮，重复离心，弃上清液。②核酸提取：向所收集菌体中加入50～100 μL核酸提取液，振荡使沉淀完全悬浮，转移至核酸提取管中，剧烈振荡5 min，95 ℃加热5 min，10 000 r/min，离心3 min，将上清液转移至洁净离心管中，取得的核酸直接进行检测。③芯片加样：按照操作说明，取出恒温扩增试剂，室温解冻，瞬时离心至管底，吸取20 μL恒温扩增试剂加入准备好的200 μL离心管中，加入34.5 μL被检核酸样品，轻摇使其充分混合均匀，瞬时离心至管底，反应体系54.5 μL；在洁净工作台内取出芯片恢复至室温，吸取50 μL上述配制好的核酸扩增体系，从进出样口1加入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道即停止加样；取1张封口膜，覆盖于进出样口上，按压至贴合紧密，固定后上机。

1.4 观察指标

①调查与记录所有患者的一般资料，包括性别、年龄、病程、体质量指数。②对所有患者的病原体检出情况进行分组，其中单一病原体感染作为单一组，包括肺炎支原体、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌等，合并感染的作为合并组。③以传统痰培养检查作为判断的金标准，判断LAMP技术在重症肺炎患者病原体的诊断价值。特异度=真阴性例数/（真阴性+假阳性）例数×100%，敏感度=真阳性例数/（真阳性+假阴性）例数×100%。

1.5 统计学分析

采用SPSS 21.0统计学软件，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料对比

在100例患者中，传统痰培养判断为单一病原体感染65例，合并病原体感染35例。合并组的性别、年龄、病程、体质量指数等与单一组对比，差异无统计学意义（P>0.05），有可比性。见表1。

表1 两组一般资料对比 [（±s）/n]

组别 例数 性别（男/女）体质量指数（kg/m2）合并组 35 18/17 50.67±3.28 11.69±0.24 21.73±1.11单一组 65 33/32 50.98±2.48 11.87±0.83 21.78±0.98 t/χ2 0.004 0.314 0.224 0.087 P 0.950 0.714 0.801 0.934年龄（岁）病程（d）

2.2 LAMP技术检测情况

在100例患者中，LAMP技术平均检测时间为（2.10±0.02）h，LAMP技术检出肺炎链球菌21例，金黄色葡萄球菌11例，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌18例，大肠埃希菌15例，铜绿假单胞菌14例，鲍曼不动杆菌22例，肺炎克雷伯菌10例，嗜麦芽窄食单胞菌9例，其他22例。传统痰培养判断为单一病原体感染65例，合并病原体感染35例，检出肺炎链球菌22例，金黄色葡萄球菌10例，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌17例，大肠埃希菌14例，铜绿假单胞菌13例，鲍曼不动杆菌22例，肺炎克雷伯菌10例，嗜麦芽窄食单胞菌8例。LAMP技术判断为单一病原体感染62例，合并病原体感染38例，LAMP技术诊断的敏感性与特异性分别为100.00%（35/35）和95.38%（62/65）。见表2。

表2 LAMP技术在重症肺炎患者病原体感染的诊断敏感性与特异性

3 讨论

近年来，重症肺炎病死率逐年升高，有文献报道，我国重症肺炎的病死率达50%[10]。临床上对肺炎的诊断主要依据影像学检测，但影像学检测的敏感度及特异性并不是100%，且部分患者会错过检查[11]。重症肺炎患者在临床指征、抗感染方面不同于普通社区获得性肺炎患者，治疗过程非常复杂，如能在疾病早期给予治疗，可降低病死率[12]。因此，确定重症肺炎患者感染的病原体至关重要。本研究显示，在100例患者中，传统痰培养判断为单一病原体感染65例，合并病原体感染35例。

传统病原学检查主要包括痰涂片、痰培养和血清学检查等，但存在以下缺陷：①痰涂片灵敏度低，只能初步识别革兰氏染色阴、阳性菌，了解细菌大致形态，不能明确具体病原菌；②痰培养是临床最常用的细菌检测手段，但培养周期较长，细菌培养的阳性率仅为45%～55%；③血清抗原抗体检测有滞后性，患者临床症状已好转，抗体检测仍可呈阳性[13]。

涂片抗酸染色法虽然具有经济要求不高、操作简单、快速得出结果等特点，但是检出限比较高，只有当痰标本中的细菌含量达到10 000条/mL左右时，才能被涂片抗酸染色法检出，检测的灵敏性有待提高。作为一种分子生物学检测方法，LAMP技术对于痰液标本中目的细菌的阳性检出率明显高于涂片抗酸染色法。特别是LAMP反应在合成DNA的过程中会释放出副产物，如偶氢离子、焦磷酸根离子，因此反应液的pH值会随着反应的过程而发生一定的变化。如果产物由初始碱性变为酸性，可使用pH敏感指示剂作为染料检测DNA扩增，有利于肉眼区分阳性与阴性，提高LAMP技术应用的灵敏性。LAMP技术与PCR技术相似，可针对目标基因DNA或cDNA在不同区域设计多条引物，利用恒温聚合酶进行恒温扩增，实验反应时间比较短，直接通过溶解曲线、扩增曲线即可判断结果[14-15]。LAMP技术可检测13种病原体，包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等，能有效区分同一病原菌的各种亚型，也能鉴别不同类型的病原菌，具有高度诊断特异性，也具有快速、简便、经济等特点[16-17]。本研究在100例患者中，LAMP技术平均检测时间为（2.10±0.02）h，检出肺炎链球菌21例，金黄色葡萄球菌11例，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌18例，大肠埃希菌15例，铜绿假单胞菌14例，鲍曼不动杆菌22例，肺炎克雷伯菌10例，嗜麦芽窄食单胞菌9例，其他22例。LAMP技术判断为单一病原体感染62例，合并病原体感染38例，LAMP技术诊断的敏感性与特异性分别为100.00%和95.38%，也说明LAMP技术在重症肺炎患者病原体检测中具有重要的价值。从机制上分析，LAMP技术核酸的扩增效率极高，1 h内产物可达靶基因的109～1010倍，不需要复杂的温控设备，对环境要求相对较低[18]。不过在具体检测过程中，要采集合格标本，用可控式负压吸痰管收集痰标本，并立即送检，采集要求涂片显示白细胞>25/LP，上皮细胞<10/LP，痰液量至少0.6 mL。LAMP技术在检测中每张芯片均设有1个阳性质控，9个阴性质控，若任一结果错误则检测结果无效，需进行复检[19]。试剂盒有阴性对照品和阳性对照品，以质控实验环境和人员操作，保证结果的准确性[20]。同时由于经费问题，本研究设置的组别比较少，没有对具体某个病原体进行对比分析，将在后续研究中探讨。

综上所述，重症肺炎患者多伴随有病原体感染情况，LAMP技术能准确快速检出重症肺炎患者病原体感染情况，具有时间短、特异性高等优势，有很好的临床应用价值。