温度与赤霉素对异味铁筷子种子萌发的影响

杨 玲， 史小华， 杜灵娟

(1.西北农林科技大学风景园林艺术学院， 陕西 杨凌 712100；2.浙江省园林植物与花卉研究所， 杭州 311202)

铁筷子(Helleborus)又叫圣诞玫瑰，是毛茛科多年生宿根草本植物[1]。铁筷子属约有20种，广泛分布于亚洲和欧洲地区。近年来，欧美及日本等国家已成功培育出许多优异的铁筷子园艺品种，并广泛应用于园林绿地、家庭盆栽及观赏。在国内，铁筷子尚未得到充分的开发利用，这主要是因为种苗依赖于进口，价格居高不下且呈逐年增长趋势。异味铁筷子(H.foetidus)原产于欧洲西部和西南部地区，是目前国内外市场最常见的铁筷子属植物之一，于早春和冬季开花，花量大，花期长且耐荫耐寒，具有很高的园林应用价值[2-5]。异味铁筷子作为欧洲的原生种，对于新品种的培育也具备丰花高抗的优势。然而，异味铁筷子种子休眠期较长、发芽率低、种苗昂贵。因此开展异味铁筷子播种繁殖技术研究，可为解决其种苗问题、促进其商品化生产和园林应用奠定技术基础，也为培育丰花高抗新优品种提供充足的亲本材料。

目前国内有关铁筷子的研究报道较少，且主要集中在块根药用方面，关于铁筷子种子繁殖的研究鲜有报道[6-7]。而国外关于铁筷子属植物的研究主要集中于组织培养，花粉等方面[5]。温度作为环境因素之一，是影响种子萌发的重要因子。种子通过感知外界温度的变化，选择合适的时机来开始植物的生活史[10]。铁筷子种子具有休眠特性，先高温后低温的温度层积可解除种子休眠[11]。赤霉素可以促进生长素的合成及增加细胞分裂素，从而提高种子内酶的活性并促进新陈代谢，对休眠的种胚作用尤其显著，是促进种子萌发的主要因素[5]。本实验用温度层积和不同质量浓度的赤霉素处理异味铁筷子种子，探究不同处理对异味铁筷子种子萌发的影响，以期为异味铁筷子种苗商品化生产和园林应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试的异味铁筷子种子购于北京世纪嘉韵科技发展有限公司，于4 ℃冰箱储存备用。

1.2 试验方法

1.2.1种子形态指标的测定

选择发育良好的种子，用体视显微镜观察种子形状、颜色和表面粗糙程度，种子长度和宽度用数显游标卡尺(精度0.001 mm)测定，重复3次，取平均值。随机选取100粒种子，用精度为0.001 g的电子天平称重，重复3次，取平均值(±标准误差)，计算种子的千粒重。

1.2.2种子含水量的测定

称取1 g种子，放入80 ℃烘箱，每隔12 h称量并记录种子的质量，直到样品恒重为止。3次重复，计算含水量，结果取平均值。

1.2.3种子吸水率的测定

将1 g饱满的种子置于装有蒸馏水的烧杯中，分别吸水2、4、6、8、10、12 h，取出种子，用滤纸吸干种子表面水分并称量，3次重复，计算平均值。

1.3 种子萌发试验

将种子在蒸馏水中浸泡24 h后，用质量分数为6%的次氯酸钠溶液消毒30 min，然后在水中冲洗3 min，滤干水分后备用。用不同温度和赤霉素分别处理种子，将处理好的种子放入垫有湿润发芽滤纸的培养皿中，放置于培养箱中进行发芽实验，每个试验设置3个重复。

1.3.125 ℃处理

将种子置于25 ℃恒温培养箱中分别处理2、4、6、8、10周后，再置于4 ℃培养箱中2周，最后放入室内温度约15 ℃条件下进行发芽实验。

1.3.2赤霉素处理

设置4个赤霉素浓度水平(100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L)，用赤霉素浸种24 h，置于垫有湿润滤纸的玻璃培养皿中，将培养皿放入25 ℃培养箱中10周后再放入4 ℃培养箱中培养2周，处理完成后，放入室内温度约15 ℃环境下进行发芽实验。

1.4 测定指标

每天定时统计种子萌发情况，以胚根露出种皮1～2 mm为发芽标准。测定指标包括：发芽率、发芽势、发芽指数、平均发芽时间、发芽启动时间，每天发芽数。

吸水率(%)=[(浸种后重量-浸种前重量)/浸种前重量] ×100%；

含水量(%)=[(烘前质量-烘后质量)/样品烘前质量]×100%；

发芽率(%)=(发芽种子数/供试种子总数)×100%；

发芽势(%)=(种子发芽高峰期内的萌发种子数/供试种子总数)×100%；

发芽指数=∑(Gt/Dt)，式中，Dt为发芽天数，Gt为与Dt相对应发芽天数内发芽的种子数；

平均发芽时间=∑(D×n)/∑n，式中,D为从种子置床起算的天数,n为相应天数的发芽粒数[16]。

1.5 数据分析

用Excel 2010软件进行数据统计、IBM SPSS Statistics 26软件进行显著性差异分析，Origin 2021软件绘图。

2 结果与分析

2.1 铁筷子种子的形态分析

由图1可知，异味铁筷子种子外形卵圆形，表皮呈黑色，光滑，也有少量光泽。由表1可知，异味铁筷子的平均长度为4.435 mm，标准差为0.254，平均宽度为2.407 mm，标准差为0.214，长宽比为1.850。种子宽度的变异系数较大，为8.891%，种子长度较为稳定，变异系数为5.727%。异味铁筷子的千粒重为13.990 g，变异系数为5.004%，重量较平均。

注：体视显微镜下种子表面(a)、(b)；体视显微镜下种子横纵切面(c)、(d)。图1 异味铁筷子种子形态特征Fig.1 Morphological Characteristics of H. foetidus seeds

表1 异味铁筷子种子形态Fig.1 Seed morphology analysis of H. foetidus

2.2 种子含水量和吸水率分析

由图2可知，随着浸水时间的延长，异味铁筷子种子吸水速度先快后缓，大多数种子在 6 h内完全吸收，之后重量恒定，0～6 h为急剧吸水阶段，吸水率从0上升到51%，平均每小时吸水速率为8%，7～12 h为饱和吸水阶段，吸水率持续动态恒定。种子含水量为(7.8±0.001)%。

图2 异味铁筷子吸水率随吸水时间的变化规律Fig.2 Variation of water absorption rate of H. foetidus with water absorption time

2.3 温度对铁筷子种子萌发的影响

由图3可见，异味铁筷子种子的发育过程主要有3个重要时期：心形胚阶段、鱼雷胚阶段和子叶胚阶段(图3)。在特定的温度条件下可以刺激异味铁筷子进一步发育，胚的后续发育受播种后持续的温度影响较大。由图4可知，不同温度层积处理对种子发芽启动时间影响不显著(p>0.05)。在2周25 ℃处理后继续2周4 ℃处理的情况下，种子的发芽率达25%，随着25 ℃处理时间的延长，发芽率逐渐升高到56.7%，在8周25 ℃处理后继续2周4 ℃处理情况下的发芽率显著高于2周25 ℃处理。在10周25 ℃处理后继续2周4 ℃处理种子的发芽率达到最高，为60%。不同处理下的种子发芽势和发芽启动时间未见明显差异(p>0.05)。随着25 ℃层积时间的延长，种子的破口率也呈递增的趋势，在10周25℃处理后继续2周4 ℃处理情况下种子的破口率相对于对照组显著增加。结果表明，在10周25℃处理后继续2周4 ℃处理能显著促进种子萌发，发芽率较ck提高了33.4%，发芽指数较ck提高了0.06，发芽率和发芽指数明显提高。

注：a为种子休眠的状态；b为心形胚阶段；c为鱼雷胚阶段；d、e为子叶胚阶段；f为胚根突破种皮。Bar=1 mm。 图3 种子萌发过程的变化情况 Fig.3 Changes of seed germination process

注：A为2周25 ℃层积后继续2周4 ℃处理；B为4周25 ℃层积后继续2周4 ℃处理；C为6周25 ℃层积后继续2周4 ℃处理；D为8周25 ℃层积后继续2周4 ℃处理；E为10周25 ℃层积后继续2周4 ℃处理。图4 25 ℃层积时间对异味铁筷子种子萌发的影响Fig.4 Effects of different temperature treatments on seed germination of H. foetidus

2.4 赤霉素对铁筷子种子萌发的影响

由图5可知，不同浓度赤霉素处理对种子发芽启动时间和平均发芽时间影响均不显著(p>0.05)。400 mg/L的赤霉素处理能显著提高异味铁筷子种子的发芽率，发芽率为73.3%，100 mg/L和400 mg/L的赤霉素处理在一定程度上显著提高了种子的发芽势和破口率(p<0.05)，其中质量浓度为400 mg/L的赤霉素处理过的种子发芽势和发芽指数显著提高(p<0.05)。结果表明，400 mg/L处理能促进种子萌发，相较于ck其发芽率提高了46.7%，发芽势增加了30%，发芽指数提高了0.02，其发芽率、发芽势和发芽指数均显著提高。

图5 不同赤霉素处理对异味铁筷子种子萌发的影响Fig.5 Effects of different gibberellin treatments on seed germination of H. foetidus

2.5 回归分析

由表2可知，以温度变化周期长短为横坐标，其发芽率为纵坐标进行回归分析，发现两者呈现二次曲线关系，达到显著性水平 (p=0.016<0.05) ，相关系数R2为0.529，在变温层积的10周时间内，随着变温层积处理时间的增长，种子发芽率也呈增长的趋势。

表2 回归分析Table 2 Regression analysis

以赤霉素溶液浓度为横坐标，种子发芽率为纵坐标进行回归分析，采用三次曲线模型，达到显著性水平 (p=0.010<0.05)，相关系数R2为0.626，最高点横坐标为400 mg/L。

3 讨 论

3.1 铁筷子属种子休眠的特性

种子休眠与萌发是两个不同的发育阶段，种子休眠决定种子发育所需要的条件，受遗传因素和环境因素的控制，给予种子适宜的环境条件后，解除抑制种子萌发的机制便可引起种子萌发[17]。了解异味铁筷子的休眠特性，对其商品化生产和园林应用尤为重要。种子休眠系统可概括为5类：生理休眠(physiological dormancy，PD)、形态休眠(morphological dormancy，MD)、形态生理休眠(morphophysiological dormancy，MPD)、物理休眠(physical dormancy，PY)和组合休眠(PY+PD)[18-19]。据报道，黑根铁筷子(H.niger)种子有简单的形态生理休眠，这是由于未发育完全的胚和生理休眠相结合而形成的，这种休眠可以通过暖温和冷温的交替处理而被打破[20]。目前的研究表明，从亲本植物散播的种子尚未发育成成熟胚，在体式显微镜下，观察到异味铁筷子有线性胚(图3)。由此判断，异味铁筷子种子可能存在形态生理休眠。赵雪艳等[1]对成熟的中国铁筷子(Helleborusthibetanus)种子解剖发现，中国铁筷子种子脱落时，种胚处于心形胚前期阶段，本研究结果与之一致(图3)。由此可见，铁筷子属植物种子均具有休眠特性。

3.2 温度层积处理对异味铁筷子种子萌发的影响

Moore L[11]研究表明，4周的暖温处理和4周的低温处理导致铁筷子(Helleborus×hybridus)胚根出现的时间最短，10周的温暖持续时间产生最高的胚根计数，而低温的持续时间对胚根出现的数量影响不显著，因此值得探讨的是较短的冷冻期是否能有效地促进铁筷子的萌发。本实验通过研究异味铁筷子种子在25 ℃的环境下处理2、4、6、8、10周后，又继续在4 ℃环境下连续处理2周，待所有处理完成后，将种子放置于15 ℃的环境下进行培养，探究在冷期处理时间固定的情况下，暖层积的处理时间对异味铁筷子种子的影响。研究发现，各温度处理对异味铁筷子的萌发无显著性差异，随着暖温持续时间的延长，对种子的萌发有促进作用，10周25 ℃处理下，种子的萌发率最高；而2周的25 ℃处理对种子的萌发有不同程度的抑制作用，可能是种子尚未达到成熟状态就开始了打破休眠的冷期处理，这对植物的萌发没有促进作用。本研究表明，种子要在25 ℃的环境下至少处理6周才能达到成熟状态。这与Moore L[11]研究结果基本一致。

3.3 不同质量浓度赤霉素处理对异味铁筷子种子萌发的影响

赤霉素是一种应用及研究上常用的植物激素，它能促进细胞延长和分裂，因此对具有休眠特性的种子，生产实践中通常选用赤霉素作为打破种子休眠的激素[21]。Moore L[11]研究认为，在暖层积前使用赤霉素处理可提高铁筷子种子的发芽率，赤霉素可以削弱围绕胚乳的机械阻力并且可以增加胚根的生长潜力，从而达到促进萌发的目的。在本实验中，不同浓度赤霉素处理对种子发芽启动时间和平均发芽时间影响均不显著，用质量浓度为100 mg/L与400 mg/L的赤霉素处理的种子发芽率显著提高，分别为70%、73.3%。结合温度组实验的结果，在暖、冷层积前使用适宜质量浓度的赤霉素浸种后可以显著促进种子萌发，其破口时间也相对缩短，这说明适宜的赤霉素处理可以促进异味筷子种子完成生理后熟。无赤霉素浸种发芽率相对较低。综上所述，适宜浓度的赤霉素可促进异味铁筷子种子萌发，赤霉素的促进效果显著高于温度处理。本研究结果可以为铁筷子的商品化生产提供理论依据。

4 结 论

异味铁筷子种子在萌发时有形态生理休眠，温度层积和赤霉素处理可打破种子休眠。对于温度处理，在2周25 ℃处理后继续2周4 ℃处理会抑制种子的萌发，但随着暖层积时间的延长，种子的萌发率呈递增的趋势，10周25 ℃处理后继续2周4 ℃处理能显著提高种子的发芽率。在赤霉素处理中，质量浓度为400 mg/L的赤霉素处理种子发芽率最高，其促进效果显著优于不同温度层积处理。通过回归分析可知，异味铁筷子种子萌发的赤霉素最适浓度为400 mg/L。