复方非交联透明质酸不同给药模式对小鼠皮肤的作用和机制探讨

毕雪婵，谢孟谚，吴 艳

（北京大学第一医院皮肤性病科 国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心 皮肤病分子诊断北京市重点实验室 国家药品监督管理局化妆品质量控制与评价重点实验室 北京 100034）

透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是一种大分子糖胺聚糖，是皮肤细胞外基质重要的组成部分，能结合多达其自身重量1 000倍的水，以提高皮肤水合和增加皮肤体积[1]。但随着年龄增加，透明质酸等细胞外基质量逐渐减少，导致皮肤水合度下降、萎缩，皮肤干燥、出现皱纹等老化表现[2]。近来透明质酸被广泛应用于化妆品和医疗美容行业，已有许多临床试验证明，滚针后涂抹或注射非交联透明质酸具有年轻化的效果，可以减轻皱纹，改善皮肤颜色、弹性、光泽度、粗糙度等，不同给药方式的临床改善效果也不同[3-5]，但透明质酸不同给药方式的具体作用机制不清。本试验拟研究复方非交联透明质酸（Compound non-cross-linked hyaluronic acid，CNCLHA）通过注射和滚针后涂抹等不同给药方式对小鼠皮肤的作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 试验动物及药物：健康的C57BL/6小鼠21只，雌性，6～8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证批号SCXK(京)2015-0001。小鼠于清洁级动物饲养室内饲养，被喂食标准饮食，购入后适应环境1周后开始试验。复方非交联透明质酸试剂为润维他化妆品有限公司的丝丽动能素Cytocare 516，批号：国妆备进字J20174673。

1.2 实验方法：本动物实验方案经北京大学第一医院实验动物伦理委员会批准。将小鼠随机分为A、B、C三组，每组7只，每组小鼠左右侧皮肤接受不同处理，共6个处理组，分别为：CNCLHA真皮注射组，CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组，CNCLHA滚针涂抹组，0.9%生理盐水滚针涂抹组，0.9%生理盐水注射组，空白对照组。每组具体处理方法如表1所示。

表1 各组具体处理方法

在实验前、第7、14天根据分组进行不同治疗，实验前及第28天分别使用经皮水分丢失测试仪Vapometer（Delfin Technologies Ltd，芬兰）测量小鼠皮肤的TEWL，Corneometer（CM825，Courage and Khazaka，德国）测量角质层含水量，Cutometer MPA 580（Courage & Khazaka electronic GmbH，德国）测量小鼠皮肤弹性。第28天取小鼠背部左右两侧皮肤，将一只小鼠一侧背部采集的皮肤标本分为3份，分别用于组织病理、Western blot及RT-PCR检测。

1.2.1 组织病理：标本用10%福尔马林固定，包埋石蜡后切片，行HE染色、马松（Masson）染色、EVG染色、阿申蓝-糖原（AB-PAS）染色及MOVAT五色染色，来观察小鼠皮肤在组织水平上的变化。以上染色所需试剂购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2.2 Western blot法：标本加裂解液进行匀浆，离心后取上清液用于Western Blot。一抗为Ⅰ型胶原（CollagenⅠ）和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体，二抗分别为HRP山羊抗兔抗体和HRP山羊抗小鼠抗体，用化学发光法使胶片显影。以上抗体均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。使用Image J软件对Western blot结果进行相对定量分析。

1.2.3 RT-PCR检测：标本经液氮研磨后用Total RNA Kit I（R6834-01，Omega）提取总RNA，TransScript cDNA Synthesis Super Mix（AT311-03，北京全式金生物技术有限公司）进行cDNA合成，SYBR Green Master Mix（A25742，Thermo Fisher Scientific）进行RT-PCR，用相对定量分析法2-△△CT计算Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ），α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的相对表达水平。引物序列如表2所示。

表2 RT-PCR所用引物序列

1.3 统计学分析：本研究所得数据用SPSS 26.0统计分析软件进行分析，用Graphpad Prism 6进行作图。数据经正态性检验，采用独立样本t检验进行统计学分析，若方差不齐则采用校正t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组皮肤生理指标改变：与基线相比，CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组及CNCLHA滚针涂抹组在第28天角质层含水量及皮肤弹性升高，TEWL降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；CNCLHA真皮注射组在第28天与基线相比，皮肤弹性升高，TEWL降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。其他处理组在第28天与基线相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组皮肤生理指标变化 （±s）

表3 各组皮肤生理指标变化 （±s）

注：各组皮肤生理指标在第28天与实验前（基线）相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

组别 角质层含水量/% 皮肤弹性 TEWL/(g/h·m2)实验前 第28天 实验前 第28天 实验前 第28天CNCLHA真皮注射组 74.27±7.22 74.09±9.43 0.2394±0.0686 0.6025±0.0923*** 11.94±2.23 6.95±2.95**CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组 73.62±7.29 85.31±3.42* 0.2767±0.1170 0.5715±0.1149** 10.79±1.27 7.03±1.75*CNCLHA滚针涂抹组 77.84±4.16 81.75±5.61* 0.4921±0.1460 0.8036±0.0684** 8.88±2.40 5.98±1.78*0.9%生理盐水滚针涂抹组 76.20±8.16 71.28±2.23 0.4762±0.0736 0.6822±0.1246 11.05±1.91 9.10±3.08 0.9%生理盐水注射组 77.02±5.55 77.34±5.90 0.6041±0.0873 0.4584±0.1258 10.23±3.45 7.12±1.48空白对照组 81.02±6.73 74.78±3.98 0.6048±0.1125 0.5164±0.0828 12.24±2.03 7.82±1.28*

2.2 各组组织病理学改变：HE染色（见图1）示第28天接受滚针治疗的处理组（CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组，CNCLHA滚针涂抹组，0.9%生理盐水滚针涂抹组）可以看到轻度表皮增厚的反应，而接受真皮注射的处理组（CNCLHA真皮注射组，0.9%生理盐水注射组）表皮增厚不明显。接受CNCLHA治疗的处理组（CNCLHA真皮注射组，CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组，CNCLHA滚针涂抹组）可见真皮不同程度增厚，真皮内胶原更加红染、致密，其中CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组真皮增厚和胶原合成增加最显著。

图1 各组小鼠皮肤组织HE染色（100×）

Masson染色可见相比于空白对照组，接受CNCLHA治疗的处理组（CNCLHA真皮注射组，CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组，CNCLHA滚针涂抹组）真皮中蓝染的胶原纤维增粗，排列紧密，胶原纤维量CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组＞CNCLHA真皮注射组＞CNCLHA滚针涂抹组。CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组与空白对照组Masson染色结果见图2。

图2 CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组与空白对照组Masson染色结果（100×）

EVG染色可见相比空白对照组，CNCLHA真皮注射组及CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组真皮内不仅胶原纤维数量增加排列紧密，并且有多数黑染的弹力纤维分布在真皮的浅中层；CNCLHA滚针涂抹组可以看到少量弹力纤维新生，主要分布在真皮的浅层。CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组与空白对照组EVG染色结果见图3。

图3 CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组与空白对照组EVG染色结果（100×）

AB-PAS染色中酸性粘多糖物质呈蓝色，中性粘多糖物质呈紫红色，混合粘多糖物质呈紫蓝色或蓝紫色。透明质酸为酸性粘多糖，蓝染物质增加说明有新合成的透明质酸。第28天可见CNCLHA真皮注射组、CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组蓝染物质明显多于其他生理盐水处理组及空白对照组，尤其是CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组。CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组与空白对照组AB-PAS染色结果见图4。

图4 CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组与空白对照组AB-PAS染色结果（100×）

MOVAT染色会使细胞核和弹力纤维呈黑色，蛋白聚糖呈绿色，胶原纤维网状纤维呈黄色。因此可以同时观察真皮细胞外基质的三种重要组分（胶原纤维、弹力纤维和透明质酸）。MOVAT染色的结果与上述结果相符，CNCLHA真皮注射组、CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组在刺激胶原纤维、弹力纤维和透明质酸新生方面效果更好，尤其是CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组。CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组与空白对照组MOVAT染色结果见图5。

图5 CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组与空白对照组MOVAT染色结果（100×）

2.3 Western blot分析：使用Western blot分析第28天各组小鼠皮肤中Collagen Ⅰ、α-SMA的蛋白表达量。结果显示，第28天所有处理组与空白对照组相比，Collagen Ⅰ均有不同程度的增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组Collagen Ⅰ含量在所有组中最高，CNCLHA真皮注射组高于0.9%生理盐水注射组，差异有统计学意义（P＜0.05）。除0.9%生理盐水注射组外，其余处理组α-SMA含量较空白对照组增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组＞CNCLHA真皮注射组＞0.9%生理盐水注射组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图6～7。

图6 Western blot分析第28天各组小鼠皮肤中Collagen Ⅰ、α-SMA蛋白表达

2.4 RT-PCR检测结果：使用RT-PCR检测不同处理组小鼠皮肤中Collagen Ⅰ和α-SMA的基因表达水平。结果显示在第28天，所有处理组小鼠皮肤中Collagen Ⅰ相对表达水平较空白对照组升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。而CNCLHA真皮注射组、CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组、CNCLHA滚针涂抹组小鼠皮肤中α-SMA表达量是空白对照组的3倍以上，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图8。

图7 第28天各组小鼠皮肤Collagen Ⅰ、α-SMA蛋白表达的相对定量结果

图8 第28天各组小鼠皮肤Collagen Ⅰ、α-SMA基因表达相对倍数

3 讨论

皮肤老化组织学上主要表现为表皮萎缩变薄以及真皮中胶原纤维、弹力纤维、透明质酸等细胞外基质减少[6]，向皮肤中补充外源性透明质酸可以增强皮肤水合能力，提升皮肤体积，改善皮肤老化的表现。由于透明质酸分子量大，直接涂抹很难通过角质层进入皮肤内部，因此临床上会采用滚针后涂抹或真皮注射的方式将透明质酸直接补充到皮肤深层。已有文献报道显示这些方法可以减轻皱纹，改善皮肤颜色、弹性、光泽度、粗糙度、经皮水分丢失、角质层含水量等[3-5]。

本实验发现单纯滚针处理（0.9%生理盐水滚针涂抹组）可以促进表皮增厚，而滚针后涂抹CNCLHA（CNCLHA滚针涂抹组）可以更好地提高角质层含水量和降低TEWL，促进皮肤屏障的修复。真皮注射CNCLHA（CNCLHA真皮注射组）则没有刺激表皮增厚的作用，而联合给药（CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组）表皮增厚和皮肤屏障修复的效果更明显。这可能是由于滚针刺破角质层，产生微损伤可以启动伤口愈合的进程，从而促进表皮再生[7]；同时滚针产生的微通道能够增加经皮药物输送（Transdermal drug delivery，TDD），使涂抹的透明质酸绕过角质层的屏障功能[8]，直接进入皮肤，提升其锁水能力，帮助修复皮肤屏障。Aust等[9]对小鼠皮肤滚针后涂抹复合维生素霜，发现与基线相比，8周后单纯滚针处理组表皮厚度增加112%，滚针后涂抹复合维生素霜组表皮厚度增加140%，HE染色观察到滚针后涂抹复合维生素霜组颗粒层增厚，表皮细胞数量增加，角质层更致密。上述结果都支持滚针治疗本身有刺激表皮再生的作用，而联合外涂产品包括本研究中的复方非交联透明质酸可以更好地促进表皮增厚，修复皮肤屏障。

本次发现滚针后涂抹CNCLHA（CNCLHA滚针涂抹组）小鼠皮肤弹性有所增加，组织病理示CNCLHA滚针涂抹组真皮浅层有少量新生胶原纤维和弹力纤维，Western blot示与空白对照组相比，CNCLHA滚针涂抹组Ⅰ型胶原蛋白水平上升（P＜0.05）。这说明滚针后涂抹非交联透明质酸不仅对于表皮有促进增生的作用，还可以通过部分上调Ⅰ型胶原蛋白来增加皮肤弹性。相关研究也显示[7]，对小鼠皮肤进行滚针后涂抹非交联透明质酸凝胶处理可以增加真皮成纤维细胞数量，促进胶原蛋白产生，刺激真皮血管增生，从而促进组织再生。

本研究还发现接受真皮注射CNCLHA（CNCLHA真皮注射组，CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组）小鼠皮肤弹性明显增加，组织病理结果显示不同程度的真皮层增厚，胶原纤维和弹力纤维新生，CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组最明显；Western blot结果示CNCLHA真皮注射组，CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组Ⅰ型胶原蛋白水平上升，且CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组＞CNCLHA真皮注射组；CNCLHA真皮注射组＞0.9%生理盐水注射组＞空白对照组，说明单纯真皮注射在增加Ⅰ型胶原蛋白水平有一定的作用，但是该作用不足够产生肉眼可见的结果以及临床改善，而真皮注射本身加上复方非交联透明质酸产品的作用才可以形成临床效果。Ⅰ型胶原蛋白是真皮中重要的结构蛋白，由成纤维细胞生成，对于保持皮肤弹性有重要作用[10]。本研究发现真皮注射或滚针后外涂复方非交联透明质酸或联合给药均可以刺激Ⅰ型胶原蛋白新生，从而提高皮肤弹性。Scarano等[11]通过人体试验得到了与本研究结果一致的结论，他们给受试者真皮注射复方非交联透明质酸，治疗后3个月病理示表皮和真皮增厚，成纤维细胞增生，血管数量增加，Masson染色和Van Gieson染色示胶原纤维增生，说明真皮注射非交联透明质酸能刺激成纤维细胞增殖，显著促进胶原蛋白、弹力纤维以及真皮基质的合成和血管新生，使真皮增厚、皮肤弹性增加。

研究中还发现，与空白对照组相比，滚针或注射CNCLHA都能增加皮肤中α-SMA水平，Western blot和RTPCR分别证实了α-SMA在蛋白和基因水平的表达增加。α-SMA是成纤维细胞分化为成熟肌成纤维细胞的标志[12]。当成纤维细胞受机械刺激、炎症或创伤时，产生的多种细胞因子尤其是TGF-β会驱动成纤维细胞分化为表达α-SMA的肌成纤维细胞，后者比前者具有更强的合成胶原等细胞外基质的能力[13]，某种意义上来说肌成纤维细胞也被认为是成纤维细胞的一种活化状态。本研究证明滚针或注射复方非交联透明质酸可以通过促进成纤维细胞活化成为表达α-SMA的肌成纤维细胞，从而促进胶原纤维等细胞外基质的合成。

本试验中发现真皮注射联合滚针后涂抹CNCLHA（CNCLHA真皮注射联合滚针涂抹组）在促进表皮增厚、改善皮肤屏障功能，以及促进真皮再生、提高皮肤弹性等方面在所有组中效果最明显。组织学结果显示表皮真皮均增厚伴全层大量新生胶原纤维和弹力纤维；Western blot和RT-PCR结果证实了联合给药作用最为明显。也有研究显示相较于单纯真皮注射非交联透明质酸，真皮注射联合滚针后涂抹的治疗方式对皮肤皱纹、颜色、毛孔、纹理等方面的改善更明显，恢复期短，患者满意度高[14]。这为临床设计治疗方案提出了非常好的指导建议，对于同时有表皮、真皮改善需求的就医者或是老化表现较为明显，希望短期有较明显改善者，建议采用真皮注射联合滚针后涂抹复方非交联透明质酸的方式，可以达到更好的临床效果。

综上所述，通过小鼠实验证实了不同的给药模式可以通过刺激表皮或真皮再生起到不同的临床效果。滚针涂抹的给药方式通过帮助大分子透明质酸经皮吸收，可以刺激表皮增生，因此在改善皮肤屏障功能和缓解皮肤干燥方面有效，但对于真皮的作用较弱。真皮注射的给药方式在促进真皮胶原纤维、弹力纤维和细胞外基质增生及重塑方面有一定效果，可以使皮肤增厚，提高皮肤弹性。而联合真皮注射和滚针后涂抹复方非交联透明质酸具备了表皮和真皮的双重疗效，各方面改善最为明显。