中链甘油三酯联合复合乳酸菌的抗疲劳作用及其机制研究

高 倩， 朴美子， 陈芊汝， 刘英华， 刘昕琦， 徐 庆

(1 青岛农业大学食品科学与工程学院， 山东青岛 266109；2青岛特种食品研究院， 山东青岛 266109；3解放军总医院第一医学中心营养科， 北京 100853)

中链甘油三酯(MCTs) 作为一种特殊的快速供能物质广泛应用于临床营养方面[1-3]。 已有研究表明, MCTs 具有提高认知能力、 提高胰岛素敏感性[4]、 减脂[5]、 减重[2]、 抗炎症[6]、 调节肠道菌群作用[7]。 在缓解疲劳方面, MCTs 能快速生酮供能、 提高脂肪抗氧化性、 抑制糖酵解和降低血乳酸浓度、 缓解肌肉酸痛[8-11]。 机体补充益生菌能促进SCFA 和脂肪酸氧化, 激活线粒体能量代谢辅助活化因子, 调节新陈代谢和能量平衡[12-13], 调节体内抗氧化酶活性, 改善运动性能、 抗炎症, 提高肌肉质量, 延缓疲劳[14-15]。 MCTs 联合复合乳酸菌在抗疲劳作用中研究较少。 本研究通过负重力竭游泳实验建立动物模型, 从能量调节、 代谢产物累积和氧化应激等3 个方面来评价MCTs 联合复合乳酸菌的抗疲劳效果。

1. 材料与方法

1.1 材料

MCTs 油剂, 由日清奥利友(中国) 投资有限公司提供, 成分见表1。 复合乳酸菌冻干粉, 购于辽宁中世生物技术有限公司(由嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌按1: 1混合, 菌粉浓度为1.01×1011CFU/g)。

表1 MCTs 中的脂肪酸种类和含量

1.2 试剂与配制

血乳酸试剂盒、 肌酸激酶试剂盒、 乳酸脱氢酶试剂盒、 血清尿素氮试剂盒、 丙二醛试剂盒、 肝/肌糖原试剂盒、 总超氧化物歧化酶试剂盒、 过氧化氢酶试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒, 均购自南京建成生物工程研究所； 无水乙醇、 冰醋酸、 浓硫酸等均为分析纯； 无水葡萄糖。 葡萄糖原液: 称取56.25 g 无水葡萄糖加适量蒸馏水加热溶解, 冷却至室温后定容到100 mL, 备用。 复合乳酸菌液: 称取3 000 mg 混合菌粉溶于60.6 mL 蒸馏水中, 分装后-20℃保存, 备用。 MCTs 灌胃液:称取5 mL MCTs 溶于15 mL 蒸馏水中, 分装备用。 MCTs＋复合乳酸菌液: 称取3 000 mg 混合菌粉溶于45.45 mL蒸馏水后加入15.15 mL MCT, 分装后-20℃保存, 备用。

1.3 仪器与设备

玻璃游泳箱(60 cm×50 cm×45 cm)、 500 W 自动恒温加热棒, 青岛永图商贸有限公司； AX423ZH 电子分析天平, 奥豪斯仪器有限公司； Spectra Max i3X 酶标仪, 美谷分子仪器有限公司； HH-4 数显恒温水浴锅,国华仪器制造有限公司； 10 ～1 000 μL 移液枪、 5430R离心机, 德国Eppendorf 公司。

1.4 实验动物及饲养条件

小鼠, 购于济南朋悦实验动物繁育有限公司, 许可证编号: SYXK (鲁) 2017 0005； 质量检测单位: 山东省实验动物中心。 选用健康的雄性Balb/c 小鼠, 7～8 w龄, 体重20～22 g, 特异性无病原体SPF 级, 共96 只。在保证通风条件良好, 温度控制在(23±3)℃, 相对湿度为(55±5)%, 光照/黑暗周期为12 h/12 h, 每间隔3 d 换1 次垫料, 自由摄食饮水。

1.5 动物实验设计

小鼠适应性喂养1 w, 每天进行30 min 游泳训练。1 w后, 将学会游泳的小鼠选出, 随机抓取称重, 每只小鼠用苦味酸做好标记。 随机分为6 组, 每组16 只,具体分组为: 空白对照组(BL)、 模型组(Md)、 MCTs组(MCT)、 复合乳酸菌组(LAC)、 MCTs ＋复合乳酸菌组(MLA)、 阳性对照组(Pt) (表2)。 小鼠每晚20:00 灌胃, 每周称量空腹体重, 并做好记录。

表2 小鼠分组及干预情况(n ＝16)

1.6 负重游泳实验

力竭游泳试验根据Kan 等[16]方法基础上稍加修改。除空白组, 每组各取1 只小鼠将其尾部悬挂占体重5 %的空心铅坠, 放入60 cm×50 cm×45 cm 游泳箱内互不接触进行同池游泳, 水深35 cm、 水温(25 ±1)℃, 游泳时尾巴不接触箱底。 按照Zhong 等[17]方法判断小鼠力竭状态。 游泳结束后, 用毛巾擦干小鼠, 放回原笼中。

1.7 实验样本收集

第42 天小鼠游泳结束后擦干, 放回原笼休息30 min,腹腔注射4%水合氯醛(0.1 mL/10 g) 麻醉, 摘眼球收集静脉丛眼球后血液收集到2 mL 肝素钠管中。 血样室温静置30 min 后, 放入低温高速离心机中, 在4℃下, 以3 000 r/min 离心10 min, 取血清分装后储存于-80℃冰箱中备用。 以断髓的方式处死小鼠, 剖取肝脏、 骨骼肌。 在冰生理盐水中冲净血渍, 滤纸吸干表面残留水分, 称重, 用锡纸包裹暂时存于液氮中, 后转入-80℃冰箱备用。

1.8 血清及组织样本测定

尿素氮(BUN)、 肌酸激酶(CK)、 乳酸(LD)、乳酸脱氢酶(LDH)、 肝糖原(LG)、 丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、 总过氧化物歧化酶(T-SOD)、 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、 肌糖原(MG), 均严格按照相应试剂盒说明书的方法测定。

1.9 统计分析

数据采用GraphPad Prism 9.0 统计软件分析及作图,所有数据均以均值±标准差形式表示, 进行单因素方差统计学分析和事后Tukey多重比较检验,P<0.05 认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 中链甘油三酯联合乳酸菌对负重游泳时间的影响

如图1 所示, 与Md 组相比, 各组游泳时间均增加(P<0.05)； 与Pt 组相比, MLA 组(P<0.01) 及MCT 组(P<0.05) 的游泳时间均显著增加, LAC 组无显著差异(P>0.05), 结果提示MCTs 和LAC 干预均能延长小鼠游泳时间,且MLA 干预的效果优于MCTs 及LAC 单独干预。

图1 干预前后负重游泳时间变化(n ＝9)

2.2 中链甘油三酯联合乳酸菌对体重的影响

如图2 所示, 干预结束时Md 组、 LAC 组、 Pt 组体重分别增加了4.07 %、 5.64 %、 2.43 %； 而MCT 组与MLA 组的体重呈下降趋势, 各组体重在干预前后无显著差异(P>0.05)。

图2 负重游泳期间体重变化(n ＝9)

2.3 中链甘油三酯联合乳酸菌对糖原的影响

糖原是运动中重要的能量来源, 含量与运动耐力成正比[18]。 干预结束各组小鼠的肌糖原(MG) 和肝糖原(LG) 储存情况如图3 所示。 与BL 组相比, 运动后各组糖原含量显著降低(P<0.05), 说明在运动中有部分糖原分解供能。 与Md 组相比, MCT 组、 LAC 组、 MLA组和Pt 组的糖原含量均增加, 有显著差异(P<0.05)。与Pt 组相比较, MCT 组和LAC 组MG 含量均差异显著(P<0.05)。 MLA 组与MCT 组和LAC 组相比均具有显著差异(P<0.01)。 结果提示, MLA 能够节约更多的糖原, 提高运动耐力。

图3 游泳后糖原的变化(n ＝9)

2.4 中链甘油三酯联合复合乳酸菌对代谢产物的影响

持续运动使BUN 和LD 积累, 导致肌肉酸痛无力,易产生疲劳[19]。 如图4 所示, 与Md 组相比, 其他各组小鼠BUN 和LD 含量均显著下降(P<0.05)。 MCT 组、LAC 组、 Pt 组BUN 分别降低了14.3 %、 17.4 %、 14.5%。 与BL 组相比, MLA 组BUN 降低了26.1 %、 LD 降低了16.4 %, 但无显著差异(P>0.05), 提示MLA 有助于减少运动中蛋白质分解。 与BL 组相比, 负重游泳使血清中LDH 和CK 含量增加。 LAC 组与MCT 组、 Pt组比较, LDH 含量无显著差异(P＝0.06、P＝0.96)；MCT 组与LAC 组和Pt 组相比, CK 含量无显著差异(P＝0.53、P＝0.10)。 MLA 组与MCT 组和LAC 组相比,LDH 和CK 降低差异显著(P<0.05), 提示MLA 可能通过减少细胞损伤, 保护肌肉组织。

图4 血清代谢产物的变化(n ＝9)

2.5 中链甘油三酯联合乳酸菌对氧化应激的影响

如图5 所示, 与BL 组相比, Md 组的MDA 含量增加了近1 倍, 抗氧化酶活性均降低, 提示负重力竭游泳会诱导小鼠体内氧化损伤。 与Md 组相比, MCT 组、LAC 组、 MLA 组、 Pt 组MDA 含 量 降 低(P<0.01),GSH-Px、 CAT 和T-SOD 活性较高(P<0.01)。 与Pt 组相比较, MCT 组和LAC 组的MDA 含量、 CAT 和T-SOD活性均无显著差异(P>0.05)； MLA 组与MCT 组和LAC 组相 比, MDA 含 量 降 低, GSH-Px、 CAT、 T-SOD活性提高, 有显著差异(P<0.05), 提示MLA 提高机体抗氧化活性。

图5 肝脏抗氧化酶活性变化(n ＝9)

3 讨论

负重力竭游泳可作为一种广泛用于评估动物运动耐力的方法[20-21], 故本研究选用负重力竭游泳, 评价MCTs、 复合乳酸菌以及两者联合干预的抗疲劳作用。

本研究中MLA 组干预后可显著延长小鼠游泳时间,优于MCTs 和LAC 单独干预, MLA 与MCTs 体重呈下降趋势, 各组体重在游泳前后无显著差异。 这与Rial 等[2]报道MCTs 可显著提高产热水平, 减少肝脏脂肪、 减轻体重的结果相符。 运动后MLA 组中MG 和LG 含量显著增加。 与Md 组相比, LG 和MG 的含量分别增加了86.49 %、 44.94 %, 提示MLA 可能有助于糖原储存, 延缓疲劳。 当机体长时间无法从碳水化合物或脂肪代谢中摄取能量, 此时蛋白质和氨基酸分解代谢率加快产生BUN, 危及肌肉收缩功能。 与Md 组比较, MLA 组的BUN 和LD 含量分别降低了26.1 %、 16.4 %。 正常情况下, LD 被LDH 催化生成丙酮酸, 然后糖异生转化生成葡萄糖为机体供能； 肌酸与CK 生成含有高能磷酸键的磷酸肌酸快速提供能量。 剧烈运动可能会导致肌肉细胞损伤, 细胞内渗透压调节紊乱, 使CK 和LDH 从细胞渗透到血液中, 故血清中CK 和LDH 活性增高提示肌肉损伤产生[22]。 与Md 相比, MCT 组和LAC 组均降低；MLA 组与MCT 组和LAC 组相比, LDH 和CK 含量降低了约15 %和27 %。 以上研究结果与齐阳[23]关于MCTs抗疲劳研究结果相符, 表明MLA 降低血清中LA、 BUN、LDH 和CK 的积累延缓肌肉疲劳。 自由基累积学说表示, 运动体内发生氧化应激, 活性氧(ROS) 含量增加, 脂质过氧化产生代谢产物MDA 并伴随抗氧化酶活性降低, 线粒体呼吸链电子传递不足产生ATP 不能为肌肉收缩提供所需能量, 因此清除自由基对缓解疲劳至关重要。 SOD、 GSH-Px 和CAT 是机体内主要内源酶防御系统。 与Md 组相比, MLA 组降低了MDA 的含量, 提高了GSH-Px、 CAT、 T-SOD 活性。 这与Sengupta 等[24]关于富含MCTs 的米糠油对氧化应激作用的结果相符,表明MLA 可能通过降低自由基或氢过氧化物形成, 减少脂质过氧化, 延缓疲劳。

综上所述, 本研究结果提示, 中链甘油三酯联合复合乳酸菌可延长运动时间提高运动耐力, 这可能与其能增加糖原储存提供ATP、 减少代谢产物的积累、 增强抗氧化酶活性、 改善氧化应激造成细胞损伤有关, 进而起到缓解疲劳的作用, 但其具体分子机制还有待进一步研究证实。