USP10与肺发育及相关疾病

林中源，张金三

1.温州大学 生命与环境科学学院，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第一医院 呼吸内科/浙江省介入肺脏病学重点实验室，浙江 温州 325000；3.浙江省生物医药协同创新中心，浙江 温州 325035

0 引言

泛素化是一种广泛存在并且严格调控的蛋白质翻译后修饰（post-translational modifications,PTMs），是控制细胞内底物蛋白最终命运的最重要机制。泛素化过程包括三个关键步骤以及三类关键蛋白的参与，包括泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）[1]。首先，E1通过消耗ATP来激活泛素（ubiquitin，Ub）；其次，E1将激活的泛素分子转移至E2；最后，E2同时携带E3以及激活形式的泛素识别靶蛋白，进一步进行泛素化修饰过程[2]。因为底物蛋白的特异性是由E3决定的，所以E3在整个泛素化过程中发挥着关键作用[3]。此外，识别、降解、亚细胞定位以及组装成底物蛋白的功能复合物都是由泛素链决定的。泛素化还分为单泛素化和多泛素化两种，单泛素化即一个Ub分子连接到靶蛋白一个或几个的赖氨酸残基上，一般发生在信号转导和囊泡分类等途径；然而，多泛素化即Ub分子链连接到靶蛋白的赖氨酸残基上，这种过程主要发生在蛋白质降解中。

去泛素化（DUBs）本质上为水解反应的去泛素化过程，DUBs将泛素分子从目标蛋白底物上分割下来，进而调控泛素连接酶的活性。泛素化-去泛素化途径共同调节多种细胞功能，包括蛋白质降解（蛋白酶体和溶酶体）、凋亡、细胞存活、细胞周期进程、染色体分离以及基因表达等[4]。DUBs属于蛋白酶超家族，其中按催化机制分为五类：天冬氨酸、金属、丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸蛋白酶[5]。DUBs大多数为半胱氨酸蛋白酶，他们与Ub进行共价结合；少数为金属蛋白酶，可以与Ub形成非共价键[6]。按照催化结构域进行分类还可以将他们分为以下七个家族：泛素特异性蛋白酶家族（USPs)、泛素C末端水解酶家族（ubiquitin C-terminal hydrolases，UCHs）、卵巢肿瘤蛋白酶家族（ovarian tumorrelated proteases，OTUs）、Machado-Josephin蛋白酶家族（Machado-Josephin disease protein domain proteases，MJDs）、Jab 1/MPN域相关金属异肽酶（Jab1/MPN domain associated metalloisopeptidase，JAMMs）和单核细胞趋化蛋白诱导蛋白家族（monocyte chemotactic proteininduced protein，MCPIP）[7]，以及最近发现的锌指含泛素肽酶1(zinc finger containing ubiquitin peptidase 1，ZUP1)[8]。在人类基因组中编码DUBs约100种，其中USPs含有超过50种[9]，这原因在于E3的数量在进化过程中增加，USP的数量也随之增加，这表明两者之间的密切关系导致了它们的共同进化[10]。USP10作为USP蛋白酶家族中的一员，其被报道特异性识别的底物已经超过20种，在人类的多种疾病中发挥重要作用。我们总结了USP10底物的相关信号通路来预测USP10在肺发育过程以及在肺疾病中的潜在影响。

1 USP10的结构特征

人源USP10基因位于染色体16q24.1，包含19个外显子，其mRNA编码的蛋白含有798个氨基酸，在进化过程中高度保守。USP10的亚细胞定位广泛，几乎表达于所有细胞的胞核及胞浆中（NCBI Gene:9100）。我们将氨基酸序列在PTMcode数据库中进行分析时发现USP10有51个潜在的转录后修饰位点，包括47个磷酸化位点和4个泛素化位点（图1A）。在DNA损伤时，ATM磷酸化USP10的Thr42及Ser337位点，使得部分USP10入核并与P53相互作用调节其泛素化水平[11]。此外，我们通过Uniprot数据库检索发现USP10含有两个结构域，分别是ataxin-2c和泛素特异性蛋白酶结构域（USP）（图1B）。

（图1A）USP10的51个潜在的翻译后修饰位点，每个矩形代表一个氨基酸，其中蓝色矩形为磷酸化位点，绿色矩形为泛素化位点，红色矩形为被ATM磷酸化的位点。（图1B）USP10含有一个ataxin-2 C-terminal域，一个USP域，一个P53结合位点以及两个PPXY基序。

2 USP10与肺发育

依据关键的形态转变肺发育过程可分为五个阶段：胚胎期、假腺期、小管期、终末囊泡期和肺泡期。在这期间肺经历了肺芽发生、细胞命运确定、分支形态发生、囊泡发育以及肺泡发育[12]。这一过程涉及细胞分子转导、细胞增殖、细胞分化以及多条相关信号通路的参与如音猬因子（Sonic hedgehog，SHH）[13]，Hippo[14]，转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β)[15]，成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）[16-17]等。这些信号通路如何稳定行使功能还有待进一步挖掘。近几年的报道中发现USP10除了调控包括P53[11],NF-B[18]，SIRT6[19]等蛋白稳定性外，还有部分底物直接影响上述参与肺脏发育信号通路并有可能对肺脏发育存在直接影响。

2.1 USP10与Hippo通路

Hippo信号通路除参与了细胞命运决定、干细胞调节、再生、免疫、肿瘤发生之外，还在发育过程中参与调节器官大小[14]。Yes相关蛋白（Yes associated protein,YAP）与带有PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）是Hippo通路中一对关键的下游效应因子[20]。TAZ KO小鼠会导致肺泡呈肺气肿样间隔变大、肺泡腔简化的发育异常，这非常类似于COPD的病症表现[21]。Morin-Kensicki等研究显示YAP KO会导致小鼠胚胎死亡[22]；最近的报道也发现特异性敲除Shh谱系中YAP会导致器官形态发生异常[21]。因此，YAP/TAZ及其调节因子被认为是肺发育异常的重要因素。YAP/TAZ的蛋白水平及功能主要通过磷酸化和泛素化等蛋白质翻译后修饰调控。大肿瘤抑制激酶（large tumor suppressor homologue 1/2，Lats1/2）诱导YAP Ser381处发生磷酸化，抑制YAP/TAZ的转录活性，随后招募E3泛素连接酶SCFβ-TRCP和泛素介导YAP降解[23]。USP10能够抑制SCFβ-TRCP和泛素参与的YAP/TAZ降解过程，逆转YAP/TAZ的泛素化水平，从而调控YAP/TAZ丰度[24]。近期Danielle R.Little团队发现在肺脏发育过程中，YAP/TAZ的缺失会影响NKX2.1与肺泡一型细胞（alveolar type 1，AT1）谱系特异性位点结合，从而影响AT1、AT2谱系的分化。这意味着USP10很有可能通过调节YAP/TAZ的稳定性，对肺泡上皮谱系的正常发育有重要意义，表明USP10对肺发育异常可能具有潜在的保护作用[25]。YAP从结构上主要分为两种剪切异构体，只含有一个WW结构域的一型YAP以及含有两个WW结构域的二型YAP，且与YAP互作的蛋白均含有PPXY基序[26]，我们在NCBI中寻找USP10的序列时发现USP10也含有两个PPXY基序（图 1B）。目前这两个结构域的存在是否和USP10与YAP的互作有关还不得而知。这表明USP10对YAP活性调节能力可能与YAP本身的亚型有关，并且预示着USP10与肺脏发育也存在着密切关系。

2.2 USP10与自噬

自噬的溶酶体降解途径在细胞，组织，机体稳态中均发挥着重要作用[27]。参与自噬通路中多种重要蛋白的水平与多种人类疾病相关如：炎症疾病，癌症以及神经退行性疾病等。USP10在近些年中也发现了几种影响自噬通路的特异性底物如：Beclin1、P62、LC3B等。USP10与USP13可通过影响Beclin1的泛素化水平影响Beclin1的稳定，进一步影响Beclin1参与的Vsp34复合体的功能。Beclin1亦可以转而影响USP10以及USP13的去泛素化活性从而影响P53蛋白水平[28]。但，USP10在肺发育假腺期的其他潜在功能目前还没有被探索和重视。肺发育过程中存在两个自噬高峰期：①E12.5；②E16.5～E18.5[29]。妊娠早期（E10.5）和妊娠晚期（E16.5）条件性敲除肺上皮细胞中Beclin1的表达会分别导致分支形成和球囊形成的减少、远端上皮分化延迟等表型[29]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），作为自噬过程中细胞能量感知以及参与细胞信号调控的重要激酶之一，在能量应激过程中人类肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）参与的AMPK磷酸化过程会因其自身的泛素化水平而受到抑制。去泛素化酶USP10可以特异性去除AMPK的泛素化，并促进LKB1磷酸化AMPK过程。能量应急时，磷酸化AMPK会磷酸化UPS10的Ser76，这使USP10对AMPK的磷酸化活性增强。USP10-AMPK正反馈环促进了细胞能量波动的调节作用[30]。因此，探究USP10在肺脏发育过程中对自噬的影响有望为临床上因自噬异常引起的肺发育异常设计靶向药物提供新思路。

3 USP10与肺癌

肺癌是全世界范围内最常见的癌症相关死亡的主要原因之一[31]。肺癌主要分为两种类别，即非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）包括肺腺癌、鳞癌和大细胞癌与小细胞肺癌。目前肺癌是以手术切除、化疗为主要的治疗方法。由于其复发率高并且对于许多化疗药物具有耐药性[32]，因此，进一步了解肺癌发病机制，寻找肺癌致病靶点，开发新的肺癌靶向药物迫在眉睫。近几年关于USP10的报道中表明，USP10在肺癌发生发展中发挥着非常重要的作用。

3.1 USP10-P53与肺癌的潜在关系

P53作为肿瘤抑制因子中重要的成员之一，可参与调控数百种基因，这些基因又参与了多种生物学活动，包括DNA损伤，细胞周期阻滞，衰老以及凋亡。在正常情况下，USP7（HAUSP）在细胞核中可直接去泛素化P53或间接的通过影响鼠双微体基因2（murine double minute 2，MDM2）来调节P53蛋白的泛素化水平。核外的P53会由USP10直接去泛素化来稳定P53。在致癌信号刺激时，部分USP10由ATM磷酸化Thr42与Ser337后入核发挥功能稳定P53[11]。有趣的是，USP10并不能像USP7那样通过影响MDM2调控P53水平。最新研究发现，在致癌信号刺激条件下USP10可以通过去泛素化和稳定p14ARF，随后p14ARF通过与MDM2的互作来调节P53的水平[33]。并且在作者发现的C-myc/p14ARF/P53通路中，C-myc可以通过与USP10的第二个启动子的结合，调控USP10的转录，进而调控p14ARF与下游P53水平。但在非小细胞肺癌中C-myc上调、USP10成正常水平、p14ARF下调。因此，C-myc/USP10/p14ARF通路在非小细胞肺癌中的重要作用，预示着治疗肿瘤的潜在靶点。此外，在肺癌中USP10还可以通过直接与PTEN的相互作用来发挥肿瘤的抑制作用[34]。最新的研究表明，真核翻译起始因子γ1（eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1，EIF4G1）在NSCLC细胞系中高表达，促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，同时作者还发现其与USP10有直接相互作用，并且USP10作为EIF4G1的负调控因子可抑制肿瘤的发生发展[35]。上述研究提示USP10/EIF4G1/P53相关机制的重要性，这可能是NSCLC类癌症的新型治疗靶点。与USP10互作的另一种底物—胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3（Insulinlike growth factor 2 mRNA-binding protein 3，IGF2BP3）也与肺癌的发生发展有关[36]。IGF2BP3 mRNA与蛋白水平主要在肺鳞癌与肺腺癌中呈高水平趋势，并且IGF2BP3的C端KH域可与USP10相互作用，通过降低USP10对P53蛋白的去泛素化活性，使P53蛋白水平和半衰期持续下降，促进肿瘤在肺部的发生、增殖和侵袭。因此，针对IGF2BP3/USP10/P53通路进行靶向药物的开发很有可能是肺癌的另一种治疗途径。

3.2 USP10-HDAC6与肺癌的潜在关系

HDAC6属于IIb级HDAC家族[37]，可参与多种蛋白的去乙酰化，包括Hsp90[38]，MSH2[39]等。HDAC6脱乙酰酶活性的失调和HDAC6的过度表达都与癌症发生和顺铂耐药有关[40-41]。并且在有P53突变的NSCLC中USP10高表达，这些研究结果表明针对USP10抑制剂的开发或许能够找到USP10-HDAC6-顺铂耐药性轴的突破口。除具有去乙酰化活性，HDAC6对于MSH2蛋白表现出E3活性，通过降低MSH2的蛋白水平使增敏正常细胞对DNA损伤。但是有趣的是，USP10不但能去泛素化稳定MSH2[42]，还可以直接去泛素和稳定组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）[43]。因此，USP10去泛素化稳定HDAC6以及MSH2的贡献程度似乎影响了肺癌发生。虽然HDAC6在NSCLC中的作用已经得到初步结论，但是HDAC6/USP10/MSH2的平衡关系在NSCLC中的作用还有待进一步探索。总之，USP10底物的多样性，导致其在肺癌中的作用错综复杂，相关的作用机制还需进一步验证。

4 USP10与肺纤维化

肺纤维化是一种慢性、不可逆和致命的间质性肺疾病，严重威胁人类健康。肺部疾病及肺纤维化的发病率随着人口老龄化而增加。最常见的肺纤维化类型是IPF，其中位生存期只有2～4年[44-45]。迄今，肺纤维化的发病机制仍不明确，并且没有有效的治疗药物。因此，阐明肺纤维化的发病机制和开发有效的治疗药物非常重要。目前公认的肺纤维化发生发展归因于成纤维细胞病灶的形成，如肺上皮间充质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）、间充质细胞的增殖和周期性成纤维细胞的募集，最终导致胶原蛋白的大量沉积，从而影响肺组织正常结构与功能[46]。USP10的下游底物分析表明，USP10在肺纤维化相关疾病中可能发挥关键作用。

4.1 去泛素化功能与肺纤维化

瘢痕和纤维化疾病的表征之一为整合素β1与β5在细胞膜表面丰度累计，从而导致TGFβ通路的进一步激活，及纤维化标志物，如α-sma等的表达。虽然还没有USP10直接影响肺纤维化的报道，但最新的研究发现整合素β1是USP10的底物蛋白[47]，并且在过去的研究中发现整合素β1于上皮位置的特异性缺失会严重影响假腺期肺上皮的初级分支[48]。提示USP10在肺纤维化以及肺发育中的潜在作用。此外USP10还与肺癌和肺纤维化发生发展中的EMT通路密切相关。例如EMT进程中Snail2，Smad4，Slug的蛋白稳定性均与USP10丰度成正相关，即USP10可以通过去泛素化作用抑制上述蛋白的蛋白酶体降解途径[49-50]，预示USP10的过表达或敲低在肺癌、肺纤维化以及肺发育中会促进或抑制EMT演进过程。

4.2 非去泛素化功能与肺纤维化

除了USP 域可能参与肺纤维化进程外，USP10去泛素化蛋白域也与CF有潜在联系。在各种应激情况下，如氧化应激，会产生高细胞毒性的泛素化蛋白，泛素化蛋白增加会导致细胞毒性，并且随着年龄的增加这种泛素化蛋白的累积量会因为蛋白酶体途径活性受损而逐渐增加。机体为减轻这种泛素化蛋白的大量累积所导致的细胞毒性，通过USP10与P62共同介导促进泛素化蛋白向泛素化蛋白聚集体的转变[51]。越来越多的证据显示，泛素化蛋白聚集体的细胞毒性较泛素化蛋白低，这也是退行性疾病的产生的主要原因之一，如肺囊性纤维化（CPF）。囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）-△F508是在CPF中最典型的易聚集蛋白。USP10的N端和C端均能与泛素受体P62蛋白结合促进（CFTR）-△F508泛素化聚集体形成来降低蛋白质低聚物的数量以降低细胞毒性，进而抑制细胞凋亡。有趣的是，虽然C端参与了互作以及后续的调控过程，这种调控并不是通过去泛素化功能来实现的[52]。以上研究表明USP10除了通过底物去泛素化发挥作用，尚有非泛素化依赖的机制有待进一步挖掘。

5 结论与展望

近年的研究不断地刷新我们对USP10功能和机制的认知。本文重点总结，并进一步推测USP10在肺脏发育、肿瘤以及肺纤维化过程中的作用及相关机制。迄今，尽管大部分USP10的研究局限于体外细胞实验，但已有应用USP10敲除鼠在肝脏和心脏相关研究报道[53-54]。相关模型也将有助于阐明USP10在肺发育的作用和相关机制，如初期支气管形成，末期肺泡发生与成熟等。另外还可以将其结合COPD、IPF和肿瘤模型探究USP10在肺部炎症、纤维化及癌症中的作用及机制。虽然USP10在肺脏发育及疾病的分子机制尚不清晰，但随着USP10研究的不断深入，更多功能以及相关机制将会逐渐被阐明。以USP10为靶点将有望为肺发育疾病及成年肺疾病挖掘新的治疗策略，为临床攻克肺脏疾病提供新思路。