大叶秦艽总环烯醚萜苷3种提取工艺优化及其抗氧化活性研究

王 萍， 王宇鹤， 许 刚， 张瑞瑞， 廖予菲， 张梦娜， 赖普辉*

(1.陕西国际商贸学院，陕西 西安 712046；2.陕西省中药绿色制造技术协同创新中心，陕西 西安 712046；3.西藏民族大学医学部临床医院，陕西 咸阳 712082；4.陕西步长制药有限公司，陕西 西安 710075)

大叶秦艽为陕西、甘肃道地药材，也是商品秦艽的主要来源，其味辛、苦，性平，具有祛风湿、清湿热、止痹痛、退虚热功效[1]，含有环烯醚萜苷、黄酮、木脂素、多糖等成分[2]，其中环烯醚萜苷是龙胆属植物特征化合物，也是秦艽活性成分之一，具有抗炎[3-5]、抗癌[6]、保肝[7-8]等作用。

目前，关于秦艽活性成分提取及抗氧化活性的文献以总黄酮[9-10]、多酚[11]、熊果酸[12]为主，鲜有涉及环烯醚萜苷。因此，本实验优化大叶秦艽回流提取、超声提取、超声-回流提取工艺，并考察其抗氧化活性，以期为后续该药材品质研究、复方制剂开发利用提供理论依据。

1 材料

TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；ME204型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；FW177型中草药粉碎机(北京市永光明医疗仪器有限公司)；KQ-400DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-S型水浴锅(巩义市英峪予华仪器厂)；DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学实验有限公司)；

龙胆苦苷对照品(DST200302-070，纯度≥96%，德思特生物科技有限公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苦基肼(纯度≥96%，美国Sigma公司)；其余试剂均为分析纯。

大叶秦艽采自陕西省宝鸡市陇县，经陕西国际商贸学院生药教研室雷国莲教授鉴定为龙胆科植物秦艽GentianamacrophyllaPall.的根。

2 方法

2.1 药材预处理 大叶秦艽饮片粉碎后过40目筛，粉末，置于干燥器中保存。

2.2 总环烯醚萜苷含量测定

2.2.1 供试品溶液制备 精密称取干燥至恒重的大叶秦艽粉末2 g，分别进行回流提取、超声提取、超声-回流提取，滤过，收集滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的龙胆苦苷对照品5.0 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得(质量浓度为0.2 mg/mL)。

2.2.3 线性关系考察 参考文献[13-14]报道并作适当修改。精密吸取对照品溶液0.25、0.50、0.75、1.0、1.25、1.50 mL至10 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，以甲醇为空白溶液，在272 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标(A)，对照品质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为A=24.338X-0.001 2(r=0.999 6)，在0.005～0.03 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 精密度试验 精密吸取0.2 mg/mL对照品溶液1 mL，按“2.2.3”项下方法测定吸光度6次，测得其RSD为1.74%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.2 重复性试验 取大叶秦艽粉末2 g，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.2.3”项下方法测定吸光度，测得其RSD为1.51%，表明该方法重复性良好。

2.2.4.3 稳定性试验 按“2.2.1”项下方法制备同一份供试品溶液，室温下放置0、2、4、6、8、10 h后按“2.2.3”项下方法测定吸光度，测得其RSD为1.44%，表明溶液在10 h内稳定性良好。

2.2.4.4 加样回收率试验 取9份1.473 3 mg/mL提取液，每份0.25 mL，按50%、100%、150%水平加入0.2 mg/mL对照品溶液，甲醇定容至50 mL，按“2.2.3”项下方法测定吸光度，测得其平均加样回收率分别为97.88%、98.83%、96.92%，RSD分别为1.51%、1.84%、1.41%。

2.3 提取工艺优化

2.3.1 回流提取工艺

2.3.1.1 单因素试验 精密称取大叶秦艽粉末2 g，考察乙醇体积分数(55%、65%、75%、85%、95%)、液料比(12∶1、16∶1、20∶1、24∶1、28∶1)、回流时间(30、60、90、120、150 min)、提取次数(1、2、3、4次)对总环烯醚萜苷含量的影响。

2.3.1.2 响应面法 在单因素试验基础上，以乙醇体积分数、液料比、提取次数、回流时间为影响因素，总环烯醚萜苷含量为评价指标进行优化。

2.3.2 超声提取工艺

2.3.2.1 单因素试验 精密称取大叶秦艽粉末2 g，考察乙醇体积分数(55%、65%、75%、85%、95%)、液料比(12∶1、16∶1、20∶1、24∶1、28∶1)、超声时间(20、30、40、50、60 min)、超声功率(160、180、200、220、240 W)对总环烯醚萜苷含量的影响。

2.3.2.2 响应面法 在单因素试验基础上，以乙醇体积分数、液料比、超声时间、超声功率为影响因素，总环烯醚萜苷含量为评价指标进行优化。

2.3.3 超声-回流提取工艺

2.3.3.1 单因素试验 精密称取大叶秦艽粉末2 g，考察乙醇体积分数(55%、65%、75%、85%、95%)、液料比(12∶1、16∶1、20∶1、24∶1、28∶1)、超声时间(20、30、40、50、60 min)、回流时间(45、60、75、90、105 min)对总环烯醚萜苷含量的影响。

2.3.3.2 响应面法 在单因素试验基础上，以乙醇体积分数、液料比、超声时间、回流时间为影响因素，总环烯醚萜苷含量为评价指标进行优化。

2.4 总环烯醚萜苷抗氧化活性研究

2.5 数据处理 实验数据均测定3次，通过Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析，Microsoft Excel 2007、Origin 8.0.6、SPSS 17.0软件进行统计学分析。

3 结果

3.1 回流提取工艺优化

3.1.1 单因素试验 见图1，最终设定乙醇体积分数为65%～85%，液料比为16∶1～24∶1，回流时间为60～120 min，提取次数为1～3次，此时总环烯醚萜苷含量有最大值。

图1 回流提取工艺中各因素对总环烯醚萜苷含量的影响

3.1.2 响应面法 因素水平见表1，结果见表2。

表1 回流提取工艺因素水平

表2 回流提取工艺设计与结果

对表2数据进行多元回归分析，得方程为Y=61.77+0.27A+1.48B+3.00C+5.90D-2.82AB-0.89AC-0.038AD-0.14BC-2.96BD-1.37CD-4.06A2-3.83B2-4.42C2-7.56D2，方差分析见表3。由此可知，模型P<0.000 1，具有高度显著性；失拟项P>0.05，表明模型拟合度良好；变异系数为4.44%，表明模型具有良好的精密度和可靠性；回流时间、提取次数对总环烯醚萜苷含量有极显著影响(P<0.01)，液料比有显著影响(P<0.05)，而乙醇体积分数无显著影响(P>0.05)。

表3 回流提取工艺方差分析

响应面分析见图2，可知最优工艺为乙醇体积分数74.80%，液料比20.24∶1，提取次数2.35次，回流时间98.58 min，考虑到操作可行性，将其修正为乙醇体积分数75%，液料比20∶1，提取次数2次，回流时间100 min，总环烯醚萜苷含量为63.29 mg/g。按上述优化工艺进行验证试验，测得总环烯醚萜苷平均含量为62.75 mg/g，与预测值63.29 mg/g接近，表明该工艺稳定可靠。

图2 回流提取工艺中各因素响应面图

3.2 超声提取工艺优化

3.2.1 单因素试验 见图3，最终设定乙醇体积分数为65%～85%，液料比为16∶1～24∶1，超声时间为30～50 min，超声功率为180～220 W，此时总环烯醚萜苷含量有最大值。

图3 超声提取工艺中各因素对总环烯醚萜苷含量的影响

3.2.2 响应面法 因素水平见表4，结果见表5。

表4 超声提取工艺因素水平

表5 超声提取工艺设计与结果

对表5数据进行多元回归分析，得方程为Y=69.60+1.81A+1.55B+1.83C+0.53D-1.94AB+0.72AC+1.06AD-0.79BC-1.51BD+3.24CD-3.88A2-2.53B2-5.65C2-3.15D2，方差分析见表6。由此可知，模型P<0.001，具有高度显著性；失拟项P>0.05，表明模型拟合度良好；变异系数为3.36%，表明模型具有良好的精密度和可靠性；超声时间对总环烯醚萜苷含量有极显著影响(P<0.01)，乙醇体积分数、液料比有显著影响(P<0.05)，而超声功率无显著影响(P>0.05)。

表6 超声提取工艺方差分析

响应面分析见图4，可知最优工艺为乙醇体积分数77.60%，液料比20.41∶1，超声时间42.35 min，超声功率204.51 W，考虑到操作可行性，将其修正为乙醇体积分数78%，液料比20∶1，超声时间42 min，超声功率204 W，总环烯醚萜苷含量为70.19 mg/g。按上述优化工艺进行验证试验，测得总环烯醚萜苷平均含量为70.25 mg/g，与预测值70.19 mg/g接近，表明该工艺稳定可靠。

图4 超声提取工艺中各因素响应面图

3.3 超声-回流提取工艺优化

3.3.1 单因素试验 见图5，最终设定乙醇体积分数为65%～85%，液料比为12∶1～20∶1，超声时间为20～40 min，回流时间为60～90 min，此时总环烯醚萜苷含量有最大值。

图5 超声-回流提取工艺中各因素对总环烯醚萜苷含量的影响

3.3.2 响应面法 因素水平见表7，结果见表8。

表7 超声-回流提取工艺因素水平

表8 超声-回流提取工艺试验与结果

对表8数据进行多元回归分析，得方程为Y=77.16-0.15A+0.93B-1.22C-2.79D+2.28AB+0.077AC-0.88AD+1.98BC+0.077BD+1.45CD-1.47A2-3.05B2-6.15C2-9.13D2，方差分析见表9。由此可知，模型P<0.000 1，具有高度显著性；失拟项P>0.05，表明模型拟合度良好；变异系数为2.21%，表明模型具有良好的精密度和可靠性；回流时间对总环烯醚萜苷含量有极显著影响(P<0.01)，液料比、超声时间显著影响(P<0.05)，而乙醇体积分数无显著影响(P>0.05)。

表9 超声-回流提取工艺方差分析

响应面分析见图6，可知最优工艺为乙醇体积分数76.46%，液料比16.72∶1，超声时间29.10 min，回流时间72.48 min，总环烯醚萜苷含量为77.55 mg/g，考虑到操作可行性，将其修正为乙醇体积分数76%，液料比17∶1，超声时间29 min，回流时间72 min。按上述优化工艺进行验证试验，测得总环烯醚萜苷平均含量为76.49 mg/g，与预测值77.55 mg/g接近，表明该工艺稳定可靠。

图6 超声-回流提取工艺中各因素响应面图

3.4 验证试验 称取大叶秦艽粉末适量，分别按3种优化工艺进行3批验证试验，结果见表10，可知超声-回流提取工艺所得总环烯醚萜苷含量最高。

表10 验证试验结果(n=3)

3.5 抗氧化活性研究 图7显示，3种提取工艺所得提取物清除DPPH、OH-自由基能力均与其质量浓度成正比，其中对前者清除率的IC50分别为2.251、2.245、1.752 mg/mL，对后者清除率的IC50分别为2.871、2.701、2.234 mg/mL，可知超声-回流提取工艺所得提取物的抗氧化活性最强。

图7 提取物对各自由基的清除率

4 讨论

环烯醚萜类成分是秦艽中含量最高的成分之一，也是其标志化合物。预实验比较了秦艽粉末提取溶剂，发现水提液中总环烯醚萜苷含量明显低于醇提液中，故本实验选择乙醇作为提取溶剂。

响应面法对试验数据进行建模，并可连续地对试验因素的各个水平分析，从而避免了正交试验精密度不高、预测性不好的缺陷，故本实验采用该方法优化大叶秦艽总环烯醚萜苷3种提取工艺，发现采用超声-回流提取法时该成分含量明显高于回流提取、超声提取，而且该方法操作简单，合理可行。

抗氧化活性实验结果显示，大叶秦艽总环烯醚萜苷质量浓度为1～4 mg/mL时，其还原能力逐渐增强，与文献[19-20]报道一致；为4 mg/mL时，超声-回流提取的总环烯醚萜苷对DPPH、OH-自由基的清除率分别达(79.75±0.78)%、(75.16±0.64)%，远高于其他2种提取方法。今后，将重点考察大叶秦艽总环烯醚萜苷提取物质量浓度与其抗氧化活性的相关性。