含淫羊藿、补骨脂中成药的用药特点分析

时潇丽， 杨德超， 徐光临， 张建伟， 刘 力

(上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021)

淫羊藿、补骨脂为常用补益类中药，前者具有补肾阳、强筋骨、祛风湿功效，而后者具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻、外用消风祛斑功效，两者均味辛性温，兼能温补肾阳，与其他补虚药配伍使用常见于治疗肾阳不足、肝肾亏损、肺肾气虚或脾肾阳虚的处方中。近年来, 相继有壮骨关节丸、仙灵骨葆胶囊等中成药引起药源性肝损伤的报道[1-2]，国家药品监督管理局也发布了相应通报[3-4]，可能与方中淫羊藿、补骨脂肝毒性相关[1-2,5]，在免疫应激状态下两者均可诱导本病，而且配伍较单用情况更严重[6]。因此，本研究对含淫羊藿、补骨脂中成药进行数据挖掘，并采用网络毒理学研究两者配伍的潜在肝毒性成分及机制，以期为科学合理地使用相关中成药提供依据。

1 资料与方法

1.1 处方收集与分析 收集2020年版《中国药典》和《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》中含有淫羊藿或补骨脂的中成药处方，其中前者含淫羊藿的中成药56种，含补骨脂的中成药43种，同时含两者的中成药11种；后者含淫羊藿的中成药180种，含补骨脂的中成药129种，同时含两者的中成药47种。排除上述2部标准均收录的6种(老年喘咳片、再造生血片、肾宝合剂、肾宝糖浆、蚕蛾公补片、益肾灵颗粒)，最终纳入同时含淫羊藿、补骨脂的中成药共52种。将上述中成药录入Excel 2019软件，参照2020年版《中国药典》和《中药学》对中药药名、药物功效分类、归经进行规范后，对药物、功效分类、归经、剂型、主治疾病频次，以及淫羊藿、补骨脂日服用量进行分析。

1.2 网络毒理学研究

1.2.1 潜在肝毒性靶点筛选 通过PubMed、知网、万方数据库检索淫羊藿、补骨脂中与肝毒性相关的活性成分,利用SwissTarget Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测其相关靶点(probability≥0.05)。在GeneCards数据库(https://www.genecards.org)中以“liver toxicity”为关键词，查找肝毒性相关靶点(score≥6.00)。采用Venny2.1在线工具将UniProt 数据库(https://www.uniprot.org)规范化后的淫羊藿、补骨脂活性成分靶点与肝毒性主要靶点进行交集分析，获得两者潜在肝毒性靶点。

1.2.2 肝毒性靶点蛋白与蛋白互作(PPI)网络构建 将潜在肝毒性靶点导入STRING数据库(https://string-db.org)中，构建靶蛋白相互作用网络(protein-protein interaction network，PPI network)，生物种类设定为“Homosapiens”，其余参数保持默认，结果保存为TSV格式并导入Cytoscape 3.6.0软件，对各靶点度值进行排序，预测淫羊藿配伍补骨脂产生肝毒性的核心靶点。

1.2.3 药物-活性成分-肝毒性靶点网络构建 将淫羊藿、补骨脂所含与肝毒性相关的活性成分和预测的潜在肝毒性靶点进行关联，采用Cytoscape 3.6.0软件构建药物-成分-肝毒性靶点网络关系图，通过“Network Analyzer”功能进行关键靶点的分析。

1.2.4 潜在肝毒性靶点功能与通路的富集分析 利用Omicshare平台候选基因作为背景，对淫羊藿、补骨脂潜在肝毒性靶点进行GO功能、KEGG信号通路富集分析，生物种类设定为“Homosapiens”，其中GO功能分析包括生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞组成(celluar component，CC)。将GO功能、KEGG信号通路富集阈值设定为P<0.001，并对两者进行可视化分析。

2 结果

2.1 中药频次、功效、归经 在2020年版《中国药典》中，木香分为木香、川木香，牛膝分为牛膝(怀牛膝)、川牛膝，附子分为附片、黑顺片，同一品种不同炮制方法按同一药材计，如“醋制五味子”“酒制五味子”“蒸五味子”均计为“五味子”，共得到227味中药，累积频数1 262次，排名前20的见表1，其中补骨脂包括生补骨脂21次、炒补骨脂5次、盐补骨脂26次，淫羊藿包括生淫羊藿31次、炙淫羊藿21次。处方中频次最多的中药是补虚药，其次是活血化瘀药、温里药、收涩药，见表2。处方中的中药主要归肾经、肝经，见表3。

表1 频次前20的中药

表2 中药功效分布

表3 中药归经分布

2.2 剂型与主治疾病 52种中成药中有9种剂型，以丸剂最多，见表4，其中至宝三鞭丸为浓缩丸或大蜜丸，壮骨关节丸为浓缩丸或水丸，共计蜜丸8种、水丸4种、水蜜丸3种、浓缩丸3种，可发挥药效持久、缓和毒性的特点，以治疗肾阳不足、气血虚弱等证型为主。另外，主治疾病包括肾系疾病、肺系疾病、肝肾疾病、脾肾疾病、关节炎等，见表5，其中有47种涉及补肾功效。

表4 中成药剂型分布

表5 中成药主治疾病分布

2.3 淫羊藿、补骨脂日服用量分析 29种中成药因处方未公布药味剂量或未详细阐述制备方法，未能计算出中成药中淫羊藿、补骨脂的日服用剂量，其余见表6(按2020年版《中国药典》用法用量中的最大服用量计算)，可知绝大多数均在6～10 g范围内，仅生白合剂(生白口服液)中淫羊藿、补骨脂，以及肺气肿片中补骨脂存在超量风险。

表6 淫羊藿、补骨脂日服用量

2.4 网络毒理学研究

2.4.1 潜在肝毒性靶点筛选 根据文献[7-17]报道，筛选出淫羊藿中与肝毒性相关的活性成分有淫羊藿素、宝藿苷Ⅰ等8种，通过SwissTarget Prediction数据库预测的靶点有122个；补骨脂中相关成分有补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚等7种，预测的靶点有264个，见表7，其中两者共有靶点有60个。再通过GeneCards数据库，获得与肝毒性相关的靶点共1 122个，将活性成分靶点与其取交集，共得到109个交集靶点，即为潜在肝毒性靶点。

表7 淫羊藿、补骨脂中与肝毒性相关的活性成分

2.4.2 潜在肝毒性靶点蛋白与蛋白互作(PPI)网络构建 采用String数据库、Cytoscape 3.6.0构建“2.4.1”项下潜在肝毒性靶点的PPI网络图，见图1，可知108个靶点之间可发生蛋白相互作用(1个靶点未参与)，其中度值≥30的靶点共16个，分别为AKT1、CASP3、EGFR、MAPK3、HSP90AA1、ESR1、MAPK1、TNF、ERBB2、PTGS2、BCL2L1、EP300、PIK3CA、PPARG、APP、MCL1，可能是核心靶点。

注：连线代表蛋白与蛋白之间的相互作用。节点越大，颜色越深，表示度值越大。

2.4.3 药物-活性成分-肝毒性靶点网络构建 构建淫羊藿、补骨脂，与肝毒性相关的活性成分，“2.4.1”项下潜在肝毒性靶点的网络，见图2。在与肝毒性相关的活性成分中，度值排名靠前的为淫羊藿中淫羊藿素、淫羊藿次苷Ⅰ，以及补骨脂中补骨脂二氢黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂乙素、补骨脂酚，推测淫羊藿与补骨脂配伍后可能通过EGFR、HSP90AA1、TNF、ERBB2、PTGS2、EP300、PPARG等核心靶点加重肝损伤，见表8。

2.4.4 富集分析 排名前20的GO、KEGG富集分析结果见图3，可知生物过程相关的条目有359条，主要涉及刺激反应、丝氨酸肽磷酸化(peptidyl-serine phosphorylation)、细胞程序性死亡(programmed cell death)等；分子功能相关的条目有53条，主要涉及催化活性(catalytic activity)、相同蛋白结合(identical protein binding)、小分子结合(small molecule binding)等；细胞组成相关的条目有32条，主要涉及细胞质部分(cytoplasmic part)、胞内细胞器内腔(intracellular organelle lumen)等，而KEGG 通路富集有116个，主要涉及癌症途径(pathways in cancer)、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway)、癌症中的中央碳代谢(central carbon metabolismin cancer)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)等。

注：蓝色节点代表淫羊藿、补骨脂，绿色节点代表与肝毒性相关的活性成分，红色、黄色节点代表肝毒性靶点(其中黄色节点为两药共有肝毒性靶点)，每条边代表节点之间的相互作用关系。

3 讨论

在2020年版《中国药典》中，同时含淫羊藿、补骨脂的中成药数量占相关中成药总数的12.5%，而在《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》中其占比为17.9%。在52种中成药中，除了正骨膏为清代宫廷御医所创验方外，其余均为院内制剂或民间验方研发制得。在国家药品不良反应监测中心分别于2001、2008年对壮骨关节丸引起肝损伤等不良反应情况进行通报[2]后，国内研究者针对壮骨关节丸的毒性药材、肝毒性机制和合理用药等进行了探索，从动物或细胞实验已证实补骨脂、淫羊藿单味药材或其中所含活性成分具有一定的肝损伤作用[7-17]。因此，存在超剂量风险的如生白合剂、肺气肿片以及长时间用药的中成药如补肾防喘片(在用法用量中注明3个月为1个疗程)等安全性需重点关注。

生白合剂(口服液)主要用于癌症放化疗引起的白细胞减少属脾肾阳虚等，制剂中淫羊藿、补骨脂的日服用剂量均大于2020年版《中国药典》用法用量，在对2 140例患者服用生白口服液的安全性研究中，共报道5例有谷丙转氨酶轻度升高，未见明显肝肾功损害或其他不良反应[18]，表明该制剂短周期服用(7～14 d)相对安全。但壮骨关节丸中淫羊藿、补骨脂日服用剂量远低于药典规定，且制剂中乳香、没药等易致肝损伤中药的日服用量也相对较低，在肝毒性病例报道中部分患者口服该制剂经常连续数月，推测发生肝脏不良反应的原因可能是长期连续服用导致药物蓄积，提示上述中药的日服用剂量虽然没有超剂量，但也应警惕长期用药安全性[2]。

合理配伍是降低中药毒性的有效措施，从而提高临床用药的安全性。黄迎等[1]基于免疫应激介导的特异质肝损伤模型，发现仙灵骨葆方中续断、知母、地黄、丹参有减轻淫羊藿、补骨脂引起的肝损伤作用，以丹参效果最好。凌洁等[19]提出斑马鱼毒性/代谢同步进程法，揭示了淫羊藿中毒及其配伍巴戟天后的减毒作用。刘巧等[20]报道，补骨脂配伍生地、制首乌等可降低补骨脂产生的肝损伤。宁青等[21]发现，杜仲中桃叶珊瑚苷可显著降低补骨脂对斑马鱼的肝脏毒性影响。在52种中成药中，续断出现11次，知母出现5次，地黄出现48次(含生地黄13次)，丹参出现5次，巴戟天出现17次，杜仲出现19次，但目前有关淫羊藿或补骨脂的配伍减毒及其机制的报道仍较少，因此，如何能在保证两者发挥最佳疗效的同时，通过药味配伍使其毒性降到最低尚有待进一步研究。

在药物-活性成分-肝毒性靶点网络的构建中发现，淫羊藿、补骨脂肝毒性关键成分通过核心靶点产生作用，与肝细胞内部分蛋白氧化磷酸化、相互结合等生物学过程及AGE-RAGE、HIF-1信号通路等相关，两者配伍后，可能通过EGFR、HSP90AA1、TNF、ERBB2、PTGS2、EP300、PPARG等核心靶点加重肝损伤。Gao等[22]参考壮骨关节丸中淫羊藿、补骨脂的剂量，通过非肝毒性剂量的脂多糖大鼠模型对淫羊藿、补骨脂、两者配伍致肝损伤问题进行研究，发现在免疫应激下，“淫羊藿与补骨脂”为一对新的中药配伍禁忌组合，NLRP3(NLR family, pyrin domaincontaining 3)炎症小体活化相关病证是其致肝损伤的主要易感人群特征[22-23]。由此可知，中药配伍禁忌是有条件和相对的，淫羊藿、补骨脂配伍合理性有待继续确证。

众所周知，“是药三分毒”，故应客观科学认识淫羊藿、补骨脂的肝损伤问题。目前，有关补骨脂、淫羊藿单味药材或其活性成分肝毒性的研究基本上为动物、细胞实验等，但所得结果往往与临床实际有一定差距。因此，医药工作者在临床上应关注含淫羊藿、补骨脂中成药的安全性，尤其是对长期用药患者，应监测其肝功能。