溶藻弧菌检测技术研究进展

◎ 刘 莹，倪春苗，李思佳，徐映如

（上海市虹口区疾病预防控制中心，上海 200082）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是革兰氏染色阴性、有鞭毛、无芽孢和荚膜的条件致病菌，在海洋和河口中分布广泛，不仅对鱼、虾、贝类等水生生物具有致病性，还能通过进食被感染的水产品和感染创口等方式引起人体食物中毒、组织坏死、中耳炎等疾病[1]。因此，能快速、灵敏、准确地检测溶藻弧菌，有助于及时阻断疾病传播，减少水产养殖业损失，维护食品安全和人类健康。

1 传统细菌检测技术

通过细菌培养技术分离病原菌，并根据菌落特征、生化反应等方法对病原菌加以鉴定是食源性病原菌的经典检测手段[2]。张晓艳等[3]先使用3%氯化钠碱性蛋白胨水对样本进行增菌，再依次接种到TCBS平板和科玛嘉弧菌显色平板上进行分离培养，然后通过生化反应鉴定目标菌落。溶藻弧菌在TCBS平板上为圆形、表面光滑、大而扁平的黄色菌落，在科玛嘉平板上为较小的无色菌落。传统细菌检测技术在检验检测实验室中应用广泛，但完成一次检测通常需要数天，不适用于大样本量或紧急情况的检测。

2 免疫学技术

2.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种十分灵敏的免疫学检测方法，原理是抗原与抗体的特异性结合，以及作为标记物的酶与底物发生的显色反应，既可以通过观察有无显色反应来做定性判断，也可以利用酶标仪测定光密度进行定量分析[4]。李明云等[5]构建了表达溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的重组质粒pET-28a-OmpK，利用该蛋白免疫小鼠得到抗血清，建立溶藻弧菌间接ELISA检测法，该方法特异性强，灵敏度为104CFU·mL-1。职通瑞等[6]以灭活溶藻弧菌为抗原制备兔抗溶藻弧菌抗体，建立了间接ELISA检测法，灵敏度为104CFU·mL-1，与副溶血性弧菌等6种弧菌无交叉反应。

2.2 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法（Colloidal Gold Immunochromatography Assy，GICA）通过观察待检物质与胶体金标记的抗原或抗体在膜上相结合发生的显色反应来检测病原菌，较ELISA更快速简便，广泛应用于现场检测及疾病初筛[7]。王蓓等[8]利用兔抗溶藻弧菌多克隆抗体制作了稳定性良好的溶藻弧菌免疫胶体金快速检测试纸，检测灵敏度为106CFU·mL-1，检测时间不超过10 min，与其他8株菌无交叉反应。李嘉文等[9]通过待检细菌样品与溶藻弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物、全菌破碎蛋白竞争性结合胶体金标记的兔抗溶藻弧菌多克隆抗体来检测溶藻弧菌，方法灵敏度为5×105CFU·mL-1，反应时间为10～15 min，与副溶血性弧菌等4种弧菌无交叉反应。

2.3 免疫磁珠分离法

免疫磁珠分离法（Immunomagnetic Beads Separation，IMBS）利用包被特异性抗体的免疫磁珠与目标抗原相结合，在磁场的作用下分离抗原，具有简易、快速、灵敏度高的优点[10]。纪勇[11]以兔抗溶藻弧菌IgG包被的免疫磁珠富集溶藻弧菌，确立了该方法中免疫磁珠的最佳工作浓度和最佳反应时间，灵敏度为 2.8 CFU·mL-1。

3 分子生物学检测技术

3.1 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）利用DNA半保留复制和碱基互补配对原理，通过一对特异性引物体外扩增目标基因片段，操作简单、灵敏快速、特异性强[12]。庞兴红等[13]针对溶藻弧菌毒力菌株HN08155的SDRH基因设计引物，使用该引物可以鉴别与HN08155菌株具有相似遗传型的溶藻弧菌毒力菌株，该方法灵敏度为1.58×102CFU·mL-1。李丹丹等[14]设计了双启动寡核苷酸引物来检测溶藻弧菌的胶原蛋白水解酶基因，双启动寡核苷酸引物比普通引物特异性更强，退火温度范围更大，该方法特异性强，灵敏度为1.14×102CFU·mL-1。

3.2 多重PCR

多重PCR（Multiplex PCR，MPCR）是指在一个PCR反应管中加入多对引物，同时扩增多个靶基因序列，因此比普通PCR的检测效率更高[15]。桑艳娇等[16]针对副溶血性弧菌和溶藻弧菌的gyrB基因设计引物，通过不断优化PCR反应体系和反应条件，建立了灵敏度高、特异性强的可同时检测副溶血性弧菌和溶藻弧菌的检测方法，其中检测溶藻弧菌的灵敏度为2.03×102CFU·mL-1。魏霜等[17]设计了5对引物——4对包括溶藻弧菌gyrB基因在内的食源性弧菌基因引物和1对细菌16S rRNA基因引物，建立了一种可以同时检测4种食源性弧菌并能排除假阴性的五重PCR检测法，对溶藻弧菌的检测灵敏度为10 CFU·mL-1。

3.3 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）在PCR反应体系中加入荧光物质，荧光物质随PCR反应而积累，通过实时监测荧光信号得到扩增曲线和CT值，从而进行基因定量检测，该方法用时短、自动化高、灵敏度高、特异性强[18]。李丹丹等[19]针对溶藻弧菌胶原蛋白水解酶基因设计引物和TaqMan探针，构建了一种特异性良好的溶藻弧菌qPCR检测法，灵敏度为18 CFU·mL-1。钟渊福等[20]针对溶藻弧菌鞭毛基因fli C设计探针引物，建立了Taqman探针qPCR检测法，灵敏度为102CFU·mL-1，特异性良好。

3.4 数字PCR

数字PCR（Digital PCR，dPCR）是第三代核酸扩增技术，通过微滴化处理将核酸样品平均分配到几十到几十万个反应单元中进行PCR反应，然后根据荧光信号阳性数和泊松分布对DNA拷贝数进行绝对定量[21]。李丹等[22]利用优化的微滴式数字PCR反应体系检测溶藻弧菌，结果显示其准确度与灵敏度均优于实时荧光定量PCR，说明该方法在低浓度DNA检测中存在优势。

3.5 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）核酸扩增在恒温下进行，不需要昂贵的仪器设备，较普通PCR和qPCR更便捷、快速、经济，该法的关键是LAMP引物的设计[23]。徐义刚等[24]针对溶藻弧菌胶原酶基因设计LAMP引物，65 ℃下反应45～60 min即可成功扩增出典型LAPM条带，用该方法检测纯培养溶藻弧菌和污染水产品中溶藻弧菌，灵敏度分别为 10 CFU·mL-1和 19 CFU·mL-1。陈昌国等[25]针对溶藻弧菌gyrB基因设计LAMP引物，结果显示最佳扩增温度和时间分别为60 ℃和60 min，该方法灵敏度为 10-4mg·L-1。

4 其他溶藻弧菌检测技术

4.1 PCR-变性高效液相色谱法

PCR-变性高效液相色谱法（PCR-Denaturing High Performance Liquid Chromatography，PCRDHPLC）指利用变性高效液相色谱法检测靶基因PCR扩增产物，然后根据样本中不同菌株的特异性峰型来判定目标菌株，与传统的PCR产物鉴定法——凝胶电泳法相比，可实现更快速、高通量的检测[26]。邵碧英等[27]在单一PCR的基础上建立了多重PCR-变性高效液相色谱法（MPCR-DHPLC），可以同时检测5种食品中的致病性弧菌——霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌。

4.2 生物芯片

生物芯片（Biochip）可以通过收集芯片载体上的生物分子探针与被标记的靶分子的杂交信号来检测病原微生物，生物分子探针有寡核苷酸、抗原、抗体等，该法具有高通量、高灵敏度、高特异性的优点[28]。丁君等[29]构建了一种可以同时检测溶藻弧菌、副溶血性弧菌等6种致病性弧菌的基因芯片。绳秀珍等[30]用6种常见鱼类病原性弧菌的外膜蛋白、胞外产物、鞭毛蛋白和全菌蛋白构建了血清学诊断抗原芯片。

4.3 生物传感器

生物传感器（Biosensor）的原理是将生物物质的浓度转化成电信号加以检测，高效、快速、灵敏，广泛应用于食品检验和环境监测等领域[31]。TIAN等[32]利用石墨烯开发了一种基于溶藻弧菌特异性DNA酶的荧光传感器，反应快速，灵敏度高，特异性强。

4.4 核酸适配体

核酸适配体（Aptamer）是通过指数富集配体系统进化技术筛选出来的与靶基因具有高特异性和亲和力的单链寡核苷酸序列[33]。林筱钧等[34]构建了磁珠-核酸适配体-荧光报告探针复合物，通过检测反应中的荧光信号实现对溶藻弧菌的定量检测。

4.5 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometer，MALDI-TOF MS）将通过软电离获得的细菌蛋白质组特异性指纹图谱与数据库中的标准菌株指纹图谱进行比对来鉴定目标菌种[35]。赵晓娟等[36]建立了溶藻弧菌MALDI-TOF MS检测法，并对实验中的影响因素进行比较评估，发现传代次数不影响检测结果，而甲酸提取法、合适的激光强度和完备的数据库可提高检测准确度。

5 结语

溶藻弧菌作为海洋和水生生物中常见的条件致病菌，对水产养殖、食品安全和人类健康都存在着潜在威胁。因此，溶藻弧菌也被列为食品安全风险监测常规监测菌种之一。随着对溶藻弧菌生物学特性的深入研究，新型检测技术和设备的不断出现，以及各种检测技术的相互结合，将来会有更多更快速、灵敏、精确、高通量的检测技术应用到溶藻弧菌的检测中去。