piRNA在结直肠癌中的研究进展

张 伟 温珍平

1 内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特市 010059； 2 内蒙古自治区肿瘤医院肿瘤内科

结直肠癌在全球发病率和死亡率都很高，严重威胁着人类的生命健康,在我国结直肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，发病率呈上升趋势，患者初诊时多处于进展期[1]，因此，亟待寻求适宜结直肠癌早期诊断的标志物。piRNA于多种人类组织中以组织特异性的方式表达，在转录或转录后水平上调节关键的信号通路，已经有研究证明piRNA与多种消化道肿瘤的发生发展密切相关，并在这些肿瘤类型中发挥着不同的作用，包括促进和抑制肿瘤。 piRNA是一类小非编码RNA，可与PIWI蛋白结合从而调控基因转录沉默过程、修饰异染色质和维持生殖系和干细胞功能等[2]。此外，肿瘤中piRNA的潜在机制也是多种多样的，包括表观遗传调控、转录后调控和翻译后调控。本文阐述piRNA相关作用机制，尤其是piRNA在结直肠癌中的作用及机制的最新研究进展，为结直肠癌的诊断治疗提供参考依据。

1 piRNA简介

在人类基因组中很少的基因(约2%)参与编码蛋白质, 而其余近98%的基因不可编码蛋白质[3]。所以根据其是否可编码蛋白质，RNA被分成编码 RNA和非编码RNA两大类。非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)是基因产生的转录本，直接起到结构、催化或调控RNA的作用，其占转录组90%以上[4]，根据生物学功能分为调控性非编码RNA和管家非编码RNA。前者包括微小RNA(microRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、小干扰RNA(siRNA)和与PIWI蛋白相互作用的piRNA；后者包括转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)等。piRNA主要在生殖细胞表达，是在性腺中触发RNA沉默的一类小非编码RNA，piRNA的5，端首位常为单磷酸的尿嘧啶核糖核酸，3’末端被甲基化修饰，通常长23～30nt，与PIWI亚家族的生殖系特异性Argonaute蛋白形成piRNA沉默复合物[5-6]。

真核生物的Argonaute蛋白在进化过程中渐演变成三种蛋白质亚家族：ago蛋白、wago蛋白和PIWI蛋白，前两者主要参与由siRNA和miRNA引起的转录后基因沉默；PIWI蛋白主要与piRNA相互作用，在生殖细胞的转座沉默过程中通过转录后基因沉默和转录基因沉默发挥重要功能[7-8]。在PIWI蛋白含有由paz和PIWI组成的结构域，当piRNA与PIWI蛋白结合时，paz优先结合piRNA中间体和5’尿嘧啶，piRNA通过3’端可被核糖核酸酶切割成熟，随后由Hen1甲基化而产生成熟的piRNA-PIWI复合体，从而影响转座子沉默、精子发生、基因组重排、表观遗传调控、蛋白质调控和生殖细胞维持[9]。

piRNA根据其来源，也可分为3类：转座子来源的piRNA、mRNA来源的piRNA和lncRNA来源的piRNA[10]。转座子派生的piRNA是从两条基因组链上转录而来，同时产生正义和反义的piRNA；mRNA派生的piRNA经过加工，通常来自3’非翻译区；lncRNA派生的piRNA来自整个转录本。自piRNA被发现以来，已有了长足进展，但人们对piRNA生物学的许多方面仍然知之甚少，可能归于两个主要原因：第一，piRNA的生物发生和沉默机制较其他的小RNA途径(如miRNA和siRNA)更复杂；第二，piRNA系统对性腺组织的限制长期以来阻碍了体外系统分析[11]。根据目前研究，产生成熟的piRNA主要靠两种机制：初级合成机制和‘乒乓’扩增机制。依据生物发生途径，piRNA可以分为初级piRNA和次级piRNA。初级piRNA的生物发生必须生成转录本，然后产生piRNA分子，并将其输出到细胞质中的加工位点。转录物被裂解成piRNA中间体，然后被加载到PIWI蛋白中，随后被修剪和甲基化以产生成熟的piRNA-PIWI复合物。初级piRNA和PIWI在细胞质中由piRNA引导启动靶切割，切断它们的目标转录本，被切割的转录本就被处理成次级piRNA。这种目标降解和piRNA扩增反应称为“乒乓循环”。实际上到目前为止，piRNA的功能仍不十分清楚。

2 piRNA与肿瘤

现有研究已证明piRNA在转录或转录后水平的生理和病理过程中发挥着重要作用，越来越多的证据也表明，piRNA与肿瘤细胞的恶性表型和临床分期密切相关。研究发现piRNA可于肿瘤组织中异常表达，如piR-651在非小细胞肺癌高表达，通过诱导cyclinD1和CDK4的表达来调节细胞增殖，从而促进肿瘤转移[12]；piR-823在多发性骨髓瘤患者中表达上调，其过表达与多发性骨髓瘤的临床分期呈正相关，抑制piR-823使得整体DNA甲基化减弱，导致甲基化沉默的p16INK4A抑癌基因被重新激活[13]；肿瘤中不只表达一类piRNA，各类piRNA在不同肿瘤中表达类型、水平不一，如胃癌中piR-32105、piR-58099和piR-59056表达增加，piR-823表达降低；肺癌中piR-55490表达下调，piR-651表达上调；在肾癌细胞中piR-43607、piR-32051和piR-39894的表达会上调[10]；piR-651在胃癌、肺癌、间皮细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞和宫颈癌细胞中表达上调，其水平与胃癌淋巴结转移(TNM)分期相关，piR-651抑制剂能抑制胃癌细胞生长，使其阻滞于G2/M期，是癌症诊断的潜在标记物[14]；乳腺癌中piR-4987高表达与淋巴结转移有关[15]，表明piRNA在肿瘤细胞增殖、转移甚至治疗中起重要作用。此外，piRNA为26～32nt的短RNA片段，意味着piRNA不容易被降解，也意味着piRNA可穿过细胞膜，可能在体液中易被分离获得[16]。这些特征使得piRNA可以在患者样本中被检测到，因此可能成为肿瘤发生发展过程中潜在的诊断和预后生物标志物。

3 piRNA 与结直肠癌

piRNA在结直肠癌中的生物学功能和相关的临床研究仍处于起步阶段。但现有的诸多证据表明piRNA在结直肠癌组织的研究极富潜力。结直肠癌组织中piRNA异常表达，但作用不同，其中一些piRNA，如piR-823、piR-54265、piR-1245、piR-18849、piR-19521和piR-17724促进肿瘤的形成，而例如piR-017724、piR-015551、piR-5937、piR-28876、piR-001311、piR-004153、piR-017723和piR-020365具有抑制作用[17]，其中piR-015551序列属于LNC00964-3，piR-015551在结直肠癌细胞中会显著升高且与LNC00964-3呈正相关，表明piR-015551可能是由LNC00964-3产生并参与了结直肠癌的发生发展过程[18]。除此之外piR59056、piR-54878和piR-62701在结直肠癌组织中也高表达，并与预后有关[11]。由此可知piRNA在结肠癌的作用不甚相同，循其特性进行研究、分类。

3.1 piRNA与结肠癌的早期诊断 结直肠癌在早期通常缺乏典型症状，大多数患者被诊断为晚期，因此，早期发现是预防和改善结直肠癌患者生存质量的关键。 目前研究证明piRNA有机会作为结直肠癌早期检测的非侵入性生物标志物。2018年欧洲学者研究指出：piRNA在癌症患者的血清中被发现与健康人群相比显著降低。根据piR-5937和piR-28876的水平，可以高度敏感和特异地区分癌症患者和健康人群。此外，这两种piRNA在Ⅰ期疾病患者中具有不错的诊断性能，并且比结肠癌目前使用的生物标记物CEA和CA19-9表现出更高的灵敏度。在手术切除后1个月，血液中的piRNA的表达也明显恢复[19]。piR-5937和piR-28876对结直肠早期诊断和预后评价作用也证明了piRNA研究的必要性。有研究表明：结直肠癌患者血清中的piR-020619和piR-020450会持续升高，但二者在肺癌、乳腺癌和胃癌患者血清的表达无明显变化，而且它们联合应用有显著的诊断价值，敏感性达72.50%，因此，这两种piRNA可能作为结直肠癌特异性循环肿瘤标志物，适用于癌前病变的早期发现，有助于降低结直肠癌的发病率和死亡率。而且多种piRNA如piR-57125可在血清和血浆样本中保持稳定，可以作为极具潜力的结肠癌早期检测生物标志物，以及可用于治疗后患者的潜在监测标志物。

3.2 piRNA与结肠癌的发生发展 研究表明，在多种肿瘤组织中检测到异常的piRNA表达，有助于肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、干性维持和耐药性。piR-015551序列在结直肠癌组织中高表达，是因为piR-015551能改变piRNA的二级结构[18]。发现piR-823在结直肠癌组织中表达上调，其可使细胞周期阻滞在G1期，并诱导细胞凋亡，这样piR-823通过上调HSF1的磷酸化及其转录后的活性来促进癌症的形成。而piR-54265通过激活STAT3信号通路促进细胞增殖，促进结直肠癌细胞的转移和侵袭，从而发挥致癌作用。此外，piRNA的表达水平与结直肠癌的临床分期和预后密切相关,如：piR-1245的高表达可能与晚期结直肠癌和淋巴结转移有关。最近的研究发现，多种癌症中piRNA的表达经常被解除调控，因此，在结直肠癌中被鉴定为过表达的piR-24000，可能是一种未被发现的潜在致癌的piRNA，并与侵袭性表型相关[20]，实际上，许多piRNA在结直肠癌发生发展过程中如何发挥功能我们尚不得而知。

3.3 piRNA与结肠癌预后治疗 与邻近的健康组织相比，结直肠癌患者肿瘤组织中piRNA的表达会显著下调。因此，piRNA有可能会作为肿瘤抑制因子发挥作用。在一些研究也表明，高水平的piRNA表达与多种癌症有关，抑制piRNA表达可以抑制癌症的发展[16]，但还需要通过详细的体外和体内研究来证实。相关研究发现：piR-54265在结直肠癌组织中的表达高于非肿瘤组织，且肿瘤或血清中的高水平与患者的生存不良显著相关，而用piR-54265抑制剂治疗可显著抑制小鼠移植性肿瘤的生长和转移。在该研究中发现：过表达的piR-54265可以防止结直肠癌细胞发生凋亡，并且与结直肠癌患者对抗癌药的耐药性和不良预后有关，但piR-54265水平是否能真正明显影响患者生存期仍待考究[21]。不过所有这些发现表明，piRNA可能是一个治疗靶点，可以作为一种肿瘤RNA来预测结直肠癌的临床转归。Weng等[22]发现piR-1245可作为结直肠癌潜在的预后生物标志物。piR-1245的功能被证明是一个癌基因，并促进了肿瘤的发展。由于piRNA可以诱导靶基因的表观遗传沉默，这些基因在未来也可能成为潜在的治疗工具。2019年有研究指出piR-19521的表达仅与肿瘤分化程度呈负相关，但piR-18849的表达与淋巴结转移潜能呈正相关，而且与肿瘤的分化程度呈负相关[23]。这表明piRNA不仅可以作为潜在的治疗靶点，还可以作为判断结直肠癌患者预后的指标。此外，piRNA还可能参与免疫过程，piRNA的生物合成及其在增强防御中的作用与适应性免疫系统对病原体的防御有一些相似之处。piRNA与表观遗传变化、基因和蛋白质调控、基因组重排和其他调控过程密切相关。虽然这些研究表明piRNA和T细胞调节之间可能存在联系，但piRNA如何通过改变其表观遗传状态来调节T细胞参与免疫过程仍有待探索。piRNA具有结合能力的优势为结直肠癌提供了一种治疗干预的手段，但远未成熟，这对结直肠癌实现精确的靶向治疗和改善预后提出了挑战。

4 结语

除了有数量巨大的piRNA，在大鼠中也已经发现可与 piRNA 相结合的被广泛表达的 rRecQ1 蛋白， 并且与翻译抑制相关联[24]，且piRNA不仅局限于生殖系细胞组织，在肿瘤组织、中枢神经系统和其他体细胞组织中也都有表达，与癌症类型、临床分期和淋巴转移相关的piRNA表达水平还存在个体差异[25]，这使得piRNA的研究面临着巨大的工程量。虽然piRNA无论在结直肠癌作用机制还是临床应用都极具潜力，但面临的挑战也同样艰巨，亟待探索研究。