表观遗传调控心脏纤维化进程的研究进展

丁羽 赵永超 赵然尊

纤维化以成纤维细胞增殖、肌成纤维细胞表型转化、胶原分泌增多及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度沉积为特征,影响组织器官的结构及功能重构,最终导致器官衰竭的发生［1］。进行性纤维化是心力衰竭中病理重构的重要基础,最终不可逆性进展为心力衰竭［2］。表观遗传学通过染色质的不同共价修饰,包括DNA 甲基化和组蛋白修饰以及与非编码RNA的相互作用影响染色质的拓扑结构,调控DNA 的转录起始、延伸、复制与修复［3］。近年来,表观遗传作为基因表达网络调控的重要方式,在心脏纤维化进展中发挥重要功能,可能为心血管疾病提供的新的诊疗见解及防治策略,本文简要综述靶向表观遗传机制在心脏纤维化发生发展中的作用及机理。

1 DNA 甲基化与心脏纤维化

DNA 甲基化是在DNA 甲基化转移酶(DNA methyl-transferase,DNMT)催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl methionine,SAM)为甲基供体,将甲基转移至CpG 岛的胞嘧啶磷酸鸟嘌呤二核苷酸共价结合形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)［4］。异常DNA甲基化可沉默或激活纤维化过程的基因表达模式,例如基因PPARa、PPARg 及RASAL1 的启动子高甲基化和转录失活与纤维发生密切相关［5］。

心肌成纤维细胞(CFs)活化是导致心脏纤维化的关键,DNMT1 介导细胞因子信号转导抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3,SOCS3)启动子超甲基化导致其在糖尿病心脏纤维化过程中表达下调,促进信号转导与转录活化因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)激活,以促进心脏成纤维细胞的激活和胶原沉积［6］。Watson 等［7］发现在缺氧导致心脏成纤维细胞中DNA 高甲基化并DNMT1和DNMT3b 高表达,并受到缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α) 的调节。使用小干扰RNA(siRNA) 或5-氮杂胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)下调DNMT3b 表达可显著降低胶原蛋白1 和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达,抑制转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β) 的促纤维化作 用［8］。TGF-β1 通过经典TGF-β/Smad 信号传导途径或丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导途径诱导细胞分化,并抑制DNMT1表达,从而抑制α-SMA 启动子区域甲基化［9］。

2 组蛋白乙酰化修饰与心脏纤维化

在真核细胞中,DNA 被浓缩在染色质内,与组蛋白共同组成核小体,每个核小体由核心组蛋白H2A、H2B、H3 和 H4 各两个分子组成。组蛋白的N 端“尾部”区域,可进行多种翻译后修饰,包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等,这些修饰以不同的方式影响染色质的紧实度和可及性［10］。乙酰化是最常见的组蛋白修饰,由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HATs) 与组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylases,HDACs)共同调控［11］。乙酰化可中和组蛋白中的碱性电荷,减弱与DNA 的相互作用,调节染色质的结构和基因活性［11］。

目前证据表明,HDAC 抑制剂(histone deacetylase inhibitor)在预防或逆转纤维发生中具有有益作用［12］。通过比较不同HDAC 抑制剂在心脏成纤维细胞中的作用机制,发现 曲古抑菌素A(TSA)、MGCD0103 和环肽Ⅰ类HDAC 抑制剂制蚜菌素均表现出促进组蛋白乙酰化的能力,并有效地阻止了心脏成纤维细胞的细胞周期进程［13］。其中MGCD0103 增加了纤维化相关基因的表达［13］。肽酶抑制因子16(peptidase inhibitor 16,PI16)是心脏成纤维细胞中特有的HDAC1 调节因子,过表达的PI16 降低了HDAC1 的核水平,导致K18 和K27 赖氨酸中组蛋白3 乙酰化水平增加,减少了心肌间胶原沉积,显著抑制成纤维细胞的增殖和纤维化相关蛋白的水平［14］。

除组蛋白外,HDAC 还可以使非组蛋白脱乙酰基化,从而控制多种细胞过程。Tao 等［15］研究发现在心脏成纤维细胞增殖和纤维化过程中,甲基-CpG 结合蛋白2(Methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2) 可能通过HDAC6 负性调控α-微管蛋白乙酰化,从而影响心脏成纤维细胞的增殖。用乙酰基转移酶p300 特异性小分子抑制剂L002 或C646 逆转高血压诱导的组蛋白乙酰化,改善左心室肥厚、心脏纤维化和舒张功能障碍［16］。

溴结构域和额外终端域家族蛋白(bromodomain and extra-terminal domain,BET)的家族可特异性识别组蛋白中乙酰化赖氨酸［17］,是一种重要的表观遗传学阅读器,它与乙酰组蛋白和转录因子结合,以控制基因表达,其家族成员溴结构域蛋白4 (bromodomaincontaining protein 4,BRD4) 作为TGF-β 信号传导效应子,活化RNA 聚合酶Ⅱ并驱动促纤维化基因表达,刺激心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转化［18］。此外,BRD4 还参与EndMT 过程,均可促进心脏纤维化发展［19］。

3 非编码RNAs 与心脏纤维化

大约99%人类基因组编码的RNA 不编码蛋白质,但是这些非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)在细胞活动的形成中起着关键的调控作用。长度大于200 个核苷酸的非编码RNA 分子称为长链非编码RNA(LncRNA)［20］。LncRNA 的表达谱可区分不同病理类型的心力衰竭,如缺血性和非缺血性心肌病［21］。LncRNA MEG3 在心脏成纤维细胞中与P53 相互作用以抑制基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的表达,可减轻心脏纤维化并改善舒张功能［22］。LncRNA Ang362 通过直接抑制Smad7 促进心肌梗死后的心脏纤维化［23］。Dusp5 作为MAPK/ERK1/2途径的重要调节因子［24］,Tao 等［25］进一步研究发现LncRNA H19 部分抑制DUSP5/ERK1/2 轴促进心脏成纤维细胞增殖。

MicroRNA (miRNA) 是一类长度约为22 个核苷酸的内源性非编码单链RNA 分子,通过结合靶mRNA 的3'非翻译区(3'UTR)作为基因表达后的转录调节因子。现有证据表明多种MicroRNA 参与成纤维细胞活化和增殖相关的纤维化调节［26］。在心肌梗死后心脏纤维化进程中,miR-29 家族靶向编码纤维化相关蛋白mRNA,包括多种胶原、纤维蛋白和弹性蛋白,此外,有人提出miR-29a 可能是肥厚型心肌病中纤维化的潜在生物标志物［27］。miR-125b 抑制纤维形成的关键脂肪细胞因子 (Apelin),诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变并改变了关键纤维化相关基因的基因表达谱,并诱导成纤维细胞增殖,促进心脏纤维化［28］。miR-21 调控PTEN/Smad7 途径,促进成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积［29］。在猪缺血/再灌注后第5 天和第19 天时冠状动脉内注射抗miR-21,RNA-seq 显示抗miR-21 治疗的心肌中miR-21靶基因组显著抑制,减轻炎症反应,抑制MAPK 信号通路,减少巨噬细胞和成纤维细胞数量,减轻了心脏纤维化和心肌细胞肥大［30］。

CircularRNA(CircRNA)是一类单链环状RNA 分子,是基因表达的新型调节因子,其机制主要为miRNA 海绵效应,转录水平及转录后调节［31］。通过CircRNA 测序,发现在TGF-β1 处理的心脏成纤维细胞中283 个与心脏纤维化相关的途径相关的差异表达基因,包括TGF-β 信号通路、PⅠ3Kakt 信号通路、AMPK 信号通路和MAPK 信号通路［32］。CircRNA 可作为miRNA海绵或竞争性内源性RNA 分子,调节靶mRNA 表达。在心脏成纤维细胞中,MiR-26b-5p 与Ⅰ型胶原α2(Recombinant Collagen TypeⅠAlpha 2,Col1α2)和结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)的3' UTR 相互作用,抑制其转录,从而发挥抗纤维化作用,CircRNA-000203 可特异“海绵”miR-26b-5p,促 进Col1α2 与CTGF 表 达［33］。circHIPK3 充 当miR-29b-3p “海绵”,改变了针对a-SMA、Col1α1、Col3α1 的 miR-29b-3p 的表达水平,逆转 miR-29b-3p对 CFs 增殖和迁移的抑制作用［34］。

4 RNAm6A 甲基化与心脏纤维化

RNA 甲基化可在mRNA 中形成N-6 甲基腺苷(N6-Methyladenosine,m6A),是最丰富的mRNA 内部修饰,m6A 修饰可影响mRNA 剪接、转运、储存、翻译或衰变,可调控各种生理过程中基因表达的动态调节机制。m6A 修饰心室重构中具有重要作用,m6A 甲基化转移酶3(methyltransferase like 3,METTL3) 及去甲基化酶肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO) 与病理性心肌肥大、纤维化密切相关［35,36］。Berulava 等［37］在终末期心脏病中,检测到2164 个转录本中发生了3208 个m6A 修饰峰,这些修饰基因功能主要与结构可塑性的过程有关,例如“调节平滑肌细胞增殖”、“细胞外基质”以及“代谢功能”等。Li 等［38］证实m6A 甲基化酶METTL3 至少部分通过Smad 介导途径调节心脏纤维化。与正常成纤维细胞相比,抑制METTL3 表达后,胶原编码基因和TGF-β/Smad 途径基因表达下调,GO 分析显示,m6A-甲基化的mRNA 与胶原相关因子和促纤维化因子如P4ha3、Tgfbi、Fgf2、Furin、Col5α1、Col6α1、Col6α2和Col6α3 表达水平降低相关［38］。METTL3 与α-酮戊二酸依赖性双加氧酶同系物5(α-Ketoglutaratedependent dioxygenase alkB homolog 5,ALKBH5)动态调节转录因子TFEB 表达,抑制METTL3 表达后,增强缺血后心肌细胞自噬通量,抑制细胞凋亡,减轻了心脏纤维化的发生［39］。

5 蛋白的翻译后修饰与心脏纤维化

蛋白质翻译后修饰(protein post-translating modification,PTM)是一种可逆过程,其可逆性以及对靶蛋白的稳定性、活性和亚细胞定位的影响,在心脏重构领域引起了广泛的关注［40］,主要修饰类型包括泛素化、类泛素蛋白修饰(SUMO)化、甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化等［41］。因此,研究PTM 作为逆转异常表观遗传修饰可能为心脏重构治疗开辟新的治疗途径。

在SUMO 修饰靶蛋白过程中,泛素缀合酶类E2I(ubiquitin-conjugating enzyme E2I,UBC9) 是目前发现的唯一E2 结合酶,UBC9 过表达可介导SUMO 化水平升高,增加心肌自噬通量,减少纤维化［42］。而沉默UBC9 可抑制早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein,PML) SUMO 修 饰［43］,从而抑制TGF-β/Smad 信号通路,促进心脏成纤维细胞向成肌纤维细胞分化［43］。进一步研究发现,PML 蛋白SUMO修饰既是TGF-β1 调节的下游靶点,同时可激活TGF-β1 表达,形成正反馈调节［44］。

泛素化调节真核生物的许多基本细胞过程,这种翻译后修饰通常由 E1、E2 和 E3 酶实现,它们分别催化激活、接合和连接反应,导致泛素的共价连接,通常连接到底物蛋白的赖氨酸残基上［45］。多项证据表明泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system,UPS)参与了心脏纤维化。Daniels 等［46］发现β 肾上腺素能(β-Adrenergic receptor,β-AR)受体刺激可增加细胞外泛素(ubiquitin,UB)水平,外源性UB 通过调节基质金属蛋白酶(MMPs)和组织金属蛋白酶抑制因子2(TIMP2)表达降低β-AR 刺激的心肌纤维化。近来研究发现外源性UB 与其受体CXC 趋化因子受体4(CXC chemokine receptor type 4,CXCR4)相互作用激活ERK1/2信号通路,调节成纤维细胞内信号、表型和功能［47］。

泛素C-末端水解酶 L1(ubiquitin C-terminal hydrolase L1,UCHL1)与葡萄糖调节蛋白78 kDa 相互作用,通过泛素化促进其降解,促进心肌纤维化［48］,其抑制剂LDN57444 可调节核因子κB(NF-κB) 信号通路,抑制成纤维细胞增殖,减弱Ⅰ型胶原和CTGF 基因的表达［49］。泛素特异性蛋白酶2(ubiquitin-specific protease 2,USP2)过表达减轻心肌肥大、炎症反应和纤维化以及减少氧化应激［50］,并与β-catenin 相互作用,调节其在CFs 中的去泛素化及稳定性,并上调细胞周期蛋白D1(cyclin D1),促进CFs 活化［51］。

6 小结

心脏纤维化导致心脏异常僵硬,最终发生心脏衰竭。表观遗传学将环境因素与基因表达联系起来,靶向纤维化相关基因调控成纤维细胞增殖、凋亡,诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,促进纤维化的发生发展。然而目前表观遗传对心脏纤维化进程的影响程度尚不十分明确,主要研究停留于基础科研阶段,需要进一步观察心脏纤维化过程中的表观遗传学变化,探索心脏纤维化机制,以延缓心脏重构进展,有望为心力衰竭提供全新的治疗方法。