包装饮用水中铜绿假单胞菌的污染情况分析

郭焜鹏，何 娟，张海韵，高 晗，杨 滔，宋 晟

（湖南省产商品质量检验研究院，食品安全监测与预警湖南省重点实验室，湖南长沙 410000）

1 背景信息

《食品安全国家标准 包装饮用水》于2015年5月24日起正式实施，标准删除了菌落总数、霉菌等项目，保留了大肠菌群检验项目的同时，新增了铜绿假单胞菌检验项目[1]。

铜绿假单胞菌又称为绿脓杆菌，是一种革兰染色阴性菌，具有单根鞭毛的细小杆菌，在土壤、空气、地表水及污水等中广泛存在，可通过水源、土壤、工器具、接触等多种途径传播，是水质污染的指示菌，对化学药剂的抵抗力比普通革兰氏阴性菌强，而且易产生耐药性。铜绿假单胞菌对常规水质消杀处理技术如紫外线、臭氧和二氧化氯等，均有很强的抵抗力，故单纯用大肠菌群作为瓶装水常规污染指示菌，并不能充分反映水质污染程度。《欧盟饮用水水质指令》（98/83/EC）也规定，瓶装或桶装饮用水中铜绿假单胞菌的指标值为0个/250 mL。美国、加拿大、巴西、日本等均限制瓶装饮用水（包括天然矿泉水水源）中铜绿假单胞菌的MPN＜3/L或每250 mL中不得检出[2]。

2 铜绿假单胞菌检出情况分析

广东省疾病预防控制中心2013—2015年在广东省21个地级市及顺德区共检测桶装水样品1 901份，检出铜绿假单胞菌阳性样品112份，阳性率为5.9%[3]。大理州疾病预防控制中心2014年至2015年对大理州内各桶装水品牌的送水销售站的66份桶装水进行检测，铜绿假单胞菌阳性检出率为6.06%[4]。河南省口岸食品检验检测所2016—2019年抽检的1 875批次的包装饮用水中，71批次检出绿假单胞菌，检出率为3.78%，432批10 L以上桶装水中检出62批，检出率为14.35%，312批矿泉水中检出2批，检出率为0.64%[5]。

本研究对长沙、株洲、岳阳、邵阳、怀化、湘西、永州和张家界等地的桶装饮用水进行三级采样，每批次5个独立样品，依据《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2016）进行检测，量取250 mL水样用抽滤泵过滤，滤膜贴于CN培养基上36 ℃培养24～48 h后取疑似阳性菌进行生理生化鉴定，共收集26株铜绿假单胞菌，并选取18株进行生物信息学分析，即对纯化菌株提取DNA后，基因组测序，分析相关基因。

3 铜绿假单胞菌的危害

铜绿假单胞菌有多种毒素因子，主要包括绿脓素、粘附素、肉毒素、弹性蛋白酶、多糖荚膜和磷脂酶C等多种外毒素、内毒素等致病因子，是导致急性肠道疾病和皮肤炎症的食源性致病菌。国内已有因铜绿假单胞菌污染饮用水导致中毒事件发生的报告。因其具有天然耐药能力，在特定条件下，它还可引起继发感染或混合感染的慢性炎症，引发肺炎、脑膜炎、败血症等严重急性感染的报道也屡见不鲜。

饮用水中的有机物质含量虽然极低，刚出厂时的桶装水中铜绿假单胞菌数量也较少，但包装水消费周期较长，保质期也至少在30 d以上，对有机营养物要求较低的铜绿假单胞菌可迅速增殖，达到104CFU·mL-1。夏季高温导致包装饮用水消费量最大，而气温更是接近于铜绿假单胞菌的最适生长温度区间，所以夏季是人感染铜绿假单胞菌的高峰期。一旦受感染，微生物将在宿主体内大量繁殖。

中国细菌耐药性监测网作为一个权威的微生物耐药监测系统在2017年对全国29所综合性医院及5所儿童医院收集到的16 562株铜绿假单胞菌的耐药性进行了分析，发现其对所测试的环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星、哌拉西林、头孢吡肟和两种酶抑制剂复合剂的耐药率小于20%[6]；在2018年对全国44所医院收集到的23 431株铜绿假单胞菌对所测试的庆大霉素、左氧氟沙星、两种酶抑制剂复合制剂、环丙沙星、哌拉西林和头孢吡肟的耐药率均≤21%[7]。

4 铜绿假单胞菌的抗消毒剂、致病性和耐药性

随着消毒剂在医疗卫生、生产包装水行业中的广泛应用，铜绿假单胞菌的抗消毒剂的特性也展现出来。深入研究后发现，铜绿假单胞菌存在多种耐消毒剂基因，对季胺盐类、双胍类、酚类、醇类和碘类等都有一定的抗性。目前关于铜绿假单胞菌耐消毒剂基因研究最多的就是qac基因家族，其可以使铜绿假单胞菌对季胺类（如苯扎溴铵）、双胍类（如氯已定）等消毒剂产生抗性[8]。

随着生物信息学的发展，研究人员通过对众多铜绿假单胞菌的基因组测序，经过分析发现有数以百计的基因编码毒力相关因子。经研究，部分致病途径有：①通过鞭毛及其他如Ⅳ型菌毛等与宿主细胞或蛋白发生粘附作用，在此基础上产生相应致病效应；②通过群体感应发挥致病作用，如调控毒素基因的表达以及形成生物膜等[9]。而生物膜又是引起饮用水企业生产质量不达标的关键因素。

魏磊等[10]对湖北、云南等全国9个省36家水厂进行采样，在采集的108个样本中分离36株铜绿假单胞菌，以P.aeruginosaATCC 15442为阳性对照，Escherichia coliATCC 25922为阴性对照，ecfX为对照基因，分别检测exoU、exoS、phzM、toxA和lasB在36株铜绿假单胞菌中的存在情况，毒力基因exoU、exoS、phzM、toxA和lasB在分离到的36株铜绿假单胞菌中的检出率高，但分离到的菌株对所选取的14种抗生素均无耐药性。

铜绿假单胞菌的耐药机制比较复杂。其主要因素有：①细菌产生抗菌活性酶，如β-内酰胺酶，能水解β-内酰胺类抗生素，导致药物失活；②突变抗菌药物作用的靶位，如DNA旋转酶等结构发生靶位改变，从而逃避抗菌药物；③外膜的微孔蛋白发生结构改变或数量减少，使外膜通透性降低，很多药物将不易进入细菌；④生物膜的形成，作为由胞外多聚物所构筑的膜样结构物理屏障，可以有效延缓或阻止大部分临床抗菌药物的渗入菌体；⑤主动泵出系统，主要功能是将菌体毒素排出体外[11]。

5 饮用水微生物污染控制

国内桶装饮用水生产过程中造成铜绿假单胞菌污染的主要风险有：①生产企业的水源和源水池的保护不当，使细菌大量繁殖；②储水器、水处理相关设备、输水和灌装线的管材被细菌污染；③水体消毒杀菌不彻底；④生产及运输过程中相关人员管控不到位，操作不规范；⑤灌装车间环境未监测、环境消杀不到位；⑥设备老旧、清洗消毒工位人员不足；⑦包材储存车间环境不规范，包材被污染；⑧回收桶消毒不彻底，清洁后堆放不规范；⑨消毒剂的配制和使用不科学；⑩缺少出厂检验和关键点风险监控[12]。

6 生产过程控制

①水源监测。企业要注意对生产饮用水的水源进行保护，定期监测。②水处理工艺。水处理装置应定期维护，如更换滤膜和滤料、检查滤膜性能，确保过滤及纯化装置的正常运转。③空气洁净度。灌装车间空气洁净度应满足《食品安全国家标准 包装饮用水生产卫生规范》（GB 19304—2018）中的要求，设置空气净化和消毒设施，空气清洁度应达到10 000级，罐装局部可达到100级为宜。④包装材料。不洁的包装材料是铜绿假单胞菌的重要传播媒介。加强回收桶的清洁消毒，尤其是对其内部的清洗[13]。⑤人员管理。人员操作不当会造成二次污染，是引起桶装饮用水铜绿假单胞菌污染的又一类突出原因。强化操作人员卫生意识，杜绝人为污染[14]。

7 结语

目前我国在基因层面研究涉及食源性或水源性铜绿假单胞菌耐药性的研究。因此，有必要评估通过全基因组测序和生物信息学进行初步研究水源性铜绿假单胞菌的相关特性基因，从而可以分析其耐药特征及变化趋势，并通过监测饮用水中铜绿假单胞菌的污染情况，为后期溯源性分析提供数据支撑，从而保障广大消费群体的饮水安全。