双衍生剂HPLC法测定玉米浆中游离氨基酸

2022-12-18 03:52
发酵科技通讯 2022年4期
关键词:流速回收率氨基酸

(1.吉林梅花氨基酸有限责任公司,吉林 白城 137000;2.通辽梅花生物科技有限公司,内蒙古 通辽 028024)

经亚硫酸溶液浸渍后,玉米种皮内可溶性蛋白质、无机盐和糖等透过种皮浸渍入水中形成稀浆,将稀浆浓缩即可制得玉米浆[1]。玉米浆是玉米湿法加工生产淀粉糖的主要副产物之一,除含有丰富的氨基酸、多肽、蛋白质和微量元素,还含有VB1、VB2、生物素和一些前体物质[2]。作为有机氮源,玉米浆在发酵过程中为菌体生长提供氮元素和必要的生长因子,用于构成菌体核酸、蛋白质和维生素等含氮物质和含氮代谢产物,对菌体生长和代谢产物的合成起着至关重要的调节作用[3-5]。因此,准确测定玉米浆中游离氨基酸浓度具有重要意义。

由于大部分氨基酸分子不含有紫外吸收官能团,所以一般先将氨基酸进行柱前衍生再进行定性定量分析,该类方法是目前测定氨基酸的主要方法。衍生化试剂主要有荧光胺(FA)[6]、邻苯二甲醛(OPA)[7-8]、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)[9-10]、2,4-二硝基氟苯(DNFB)[11-12]、异硫氰酸苯酯(PITC)[13-15]、丹磺酰氯(Dansyl-Cl)[16-17]和6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)[18-19]。由于玉米浆中的氨基酸种类繁多且结构相近,所以使用单一衍生试剂难以满足同时对所有一、二级氨基酸分离的要求,难以达到定性和精确定量的目的。因此,笔者通过建立基于OPA-FMOC双衍生剂的HPLC法,实现对玉米浆中所有一、二级游离氨基酸的定性和精确定量分析。所有一级氨基酸先与OPA反应,生成异吲哚类物质,在338 nm处有最大吸收[20];一级氨基酸全部反应完全后,加入FMOC与二级氨基酸反应,产物在262 nm处有最大吸收[20]。因为FMOC衍生物(即FMOC与二级氨基酸反应产物)比任何OPA衍生物(上述异吲哚类物质)的疏水性都强,所以它不会干扰任何一级氨基酸的检测,经高效液相分离后根据保留时间进行定性,利用外标法定量。

1 材料和方法

1.1 材 料

玉米浆,通辽梅花生物科技有限公司自产。

1.2 试 剂

乙腈、甲醇,色谱纯;浓度分别为25,100,250,1 000 pmol/μL的17种氨基酸混标、OPA、FMOC、硼酸缓冲液,Agilent Technologies;蒸馏水;二水合磷酸二氢钠、NaOH,国产分析纯。

1.3 主要仪器与设备

高效液相色谱仪1260,Agilent Technologies;电子天平(万分之一)、pH计,METTLER TOLEDO仪器有限公司;50 mL容量瓶、1 L玻璃烧杯、超纯水机、真空泵、溶剂过滤器、磁力搅拌器,市购。

1.4 方法条件

流动相为40 mmol/L的NaH2PO4水溶液,用浓度为10 mol/L的NaOH调pH=7.8,过膜超声后为流动相A;V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(超纯水)=45∶45∶10,超声混匀后为流动相B。

衍生剂为V(OPA)∶V(FMOC)∶V(样品)=0.5∶0.5∶1;色谱柱型号ZORBAX Eclipse AAA 4.6 mm×75 mm 3.5-Micron;柱温设为40 ℃;VWD波长分别为338,262 nm。

OPA衍生氨基酸反应方程式为

FMOC衍生氨基酸反应方程式为

化学工作站程序设置如表1所示。

表1 流动相工作程序

2 结果与分析

2.1 分离条件优化

2.1.1 衍生剂用量对氨基酸分离的影响

对V(OPA)∶V(FMOC)∶V(样品)分别为0.2∶0.2∶1,0.5∶0.5∶1,1∶1∶1的衍生剂进行氨基酸标品分析,色谱图结果表明:当衍生剂加入量分别为0.5,1 μL时,各衍生物峰面积值一致,说明衍生反应彻底,可以得出准确结果;当衍生剂加入量为0.2 μL时,峰面积偏小,计算结果偏低,说明不能将样品中的氨基酸完全衍生化。为达到完全衍生及提高衍生剂利用率的目的,最终采用衍生剂为V(OPA)∶V(FMOC)∶V(样品)=0.5∶0.5∶1。

2.1.2 流动相浓度对氨基酸分离的影响

配制浓度分别为10,40,100 mmol/L的NaH2PO4水溶液,用浓度为10 mol/L的NaOH调pH=7.8,进行氨基酸混合标品分析。色谱图结果表明:当浓度为40 mmol/L时,分离度>1.5,峰型好,峰面积适中,为最佳流动相浓度;低浓度流动相(10 mmol/L)时的氨基酸的基线峰宽大,分离度差,测量误差大;高浓度流动相(100 mmol/L)时的氨基酸基线,虽然峰型好,分离度适中,但有盐析出,易造成堵塞,对色谱柱、仪器损伤大。因此,笔者最终采用的浓度为40 mmol/L NaH2PO4水溶液作为流动相。

2.1.3 流速对氨基酸分离的影响

对不同流速(1.5,2,2.5 mL/min)的氨基酸混合标品进行分析,色谱图结果表明:最佳的流动相流速为2 mL/min;低流速流动相(1.5 mL/min)时的氨基酸分离时间长,色谱峰拖尾;高流速流动相(2.5 mL/min)时的氨基酸保留时间间隔短,峰易重叠,且柱压高,对色谱柱、仪器损伤较大。因此,笔者最终采用流速为2 mL/min。

2.1.4 最佳分离条件下的色谱图

综合以上3个因素,择定分离条件:流动相A为40 mmol/L的NaH2PO4水溶液,pH=7.8;流动相B为V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10;衍生剂为V(OPA)∶V(FMOC)∶V(样品)=0.5∶0.5∶1;流速为2 mL/min。该条件下可以达到最佳分离效果,氨基酸标准品浓度为100 pmol/μL。最佳条件下的色谱图如图1所示。

1—天冬氨酸;2—谷氨酸;3—丝氨酸;4—组氨酸;5—甘氨酸;6—苏氨酸;7—精氨酸;8—丙氨酸;9—酪氨酸;10—半胱氨酸; 11—缬氨酸;12—蛋氨酸;13—苯丙氨酸;14—异亮氨酸;15—亮氨酸;16—赖氨酸;17—脯氨酸。

由图1知:在最佳分离条件下,17种氨基酸混标标准品在10 min内可完全分离开,分离度良好;在信号强度为0~10 mAu时,峰面积适中,峰型好。

2.2 标准曲线的制作

依次检测4个氨基酸混标标准品(浓度分别为25,100,250,1 000 pmol/μL),使用Agilent化学工作站对各色谱峰进行积分,获得各峰的峰面积,以各浓度对应的峰面积为纵坐标,以进样浓度为横坐标,绘制标准曲线,得到线性回归方程和相关系数,具体结果如表2所示。

表2 氨基酸标准曲线方程

由表2可知:当浓度为25~1 000 pmol/μL时,17种氨基酸混标标准品的线性相关系数均在0.999以上,说明相关性良好。

2.3 精密度考察

对浓度为100 pmol/μL的混标连续5次进样,获得17种氨基酸的保留时间的相对平均偏差RSD和峰面积的RSD(n=5),结果如表3所示。

表3 新方法峰面积和保留时间的精密度

由表3可知:17种氨基酸的保留时间的RSD为0.01%~0.15%,峰面积的RSD(n=5)为2.03%~3.17%,表明新方法的重现性较好,精密度较高。

2.4 对比实验

将玉米浆样品分成2份:1份样品送至专业检测单位(梅花集团,廊坊市经济技术开发区华祥路66号),利用氨基酸分析仪测定氨基酸质量浓度,具体参考GB/T 30987—2020《植物中游离氨基酸的测定》;另1份样品使用新方法测定氨基酸质量浓度。

对2份样品进行对比实验,结果如表4所示。

表4 新方法与氨基酸分析仪结果对比

由表4可知:采用新方法与利用氨基酸分析仪检测所得数据基本一致,故可以将新方法应用于玉米浆中游离氨基酸浓度的检测。

2.5 加标回收实验

取玉米浆1份,稀释50倍过膜,与浓度为1 000 pmol/μL的混合标准液按体积比1∶1混匀后依次衍生化进样分析,得到各氨基酸加标回收率,结果如表5所示。

表5 玉米浆加标回收结果

由表5可知:通过对比5种样本,发现17种氨基酸加标回收率为90.16%~104.55%(表5中只列出样1加标回收率,其余4种样本加标回收率未列出,皆在95%~105%范围内),回收率高,说明新方法适合被测基质(即玉米浆)中游离氨基酸浓度的检测。

氨基酸标准混合样与玉米浆样的叠加色谱图如图2所示。图2中:曲线外圈为玉米浆,内部为氨基酸混标。

1—天冬氨酸;2—谷氨酸;3—丝氨酸;4—组氨酸;5—甘氨酸;6—苏氨酸;7—精氨酸;8—丙氨酸;9—酪氨酸;10—半胱氨酸; 11—缬氨酸;12—蛋氨酸;13—苯丙氨酸;14—异亮氨酸;15—亮氨酸;16—赖氨酸;17—脯氨酸;A—峰面积30.044 7; B—峰面积89.423 8;C—峰面积68.297 4;D—峰面积1.683 42。

由图2可知:玉米浆中的氨基酸有一级氨基酸天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸,二级氨基酸脯氨酸。说明玉米浆中氨基酸种类多,营养丰富,作为有机氮源,在发酵过程中对菌体生长和代谢产物合成起着至关重要的调节作用。

3 结 论

通过建立基于OPA-FMOC的双衍生剂HPLC法,实现对玉米浆中所有一、二级游离氨基酸的定性和精确定量分析。确定最佳衍生剂配比为V(OPA)∶V(FMOC)∶V(样品)=0.5∶0.5∶1;最佳色谱条件:色谱柱为ZORBAX Eclipse AAA 4.6 mm×75 mm 3.5-Micron,柱温为40 ℃;流动相A为40 mmol/L的NaH2PO4水溶液,pH=7.8;流动相B为V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10;流速为2 mL/min,梯度洗脱;流速为2 mL/min;VWD波长分别为338,262 nm。在该条件下,所测得17种氨基酸混标标准品的线性相关系数均在0.999以上,保留时间的RSD为0.01%~0.15%,峰面积的RSD为2.03%~3.17%,样品加标回收率为90%~105%。新方法具有操作步骤简单、高效、稳定性好、灵敏度高、分离效能好和精密度较高等优点,可以用于对玉米浆中游离氨基酸浓度的测定。

猜你喜欢
流速回收率氨基酸
液体压强与流速的关系
『流体压强与流速的关系』知识巩固
不同形态氮肥对棉花15N回收率和产量的影响
全国农膜回收率年底前达到80%以上
山雨欲来风满楼之流体压强与流速
月桂酰丙氨基酸钠的抑菌性能研究
爱虚张声势的水
UFLC-QTRAP-MS/MS法同时测定绞股蓝中11种氨基酸
HPLC法同时测定阿胶强骨口服液中4种氨基酸
一株Nsp2蛋白自然缺失123个氨基酸的PRRSV分离和鉴定