复合菌固体发酵蛋壳粉制备乳酸钙

(湖南农业大学 生物科学技术学院,湖南 长沙 410128)

我国每年产生大量的废弃鸡蛋壳,如果不及时对它们加以处理,鸡蛋壳中的残余物就可能会对环境造成污染。此外,由于鸡蛋壳中约93%的成分为碳酸钙,这也将在一定程度上导致大量的钙元素被浪费[1-2]。随着全球对环保问题关注度的提升,越来越多的研究者开展了有关废弃蛋壳再利用的研究。对鸡蛋壳的有效再利用不但对生态环境具有保护作用,而且能提高以鸡蛋为原料的产品的附加值,并促进我国蛋鸡产业的可持续发展[3]。目前,我国利用废弃鸡蛋壳提取钙元素的方式之一是将鸡蛋壳中的碳酸钙通过各种手段转化成其他附加值更高形式的钙,比如乳酸钙、葡萄糖酸钙和丙酸钙等有机酸钙[4]。将乳酸钙添加到饲料中对家畜的健康具有正面效果,王继华等[5]和Suiryanrayna等[6]的研究显示:乳酸钙在仔猪的肠道中可以降低饲料的系酸力,有选择性地刺激有益细菌生长并增加肠壁吸收营养物质的效率,进而改善仔猪健康,特别是对于新断奶仔猪较为有益。与其他常用的转化蛋壳源碳酸钙为乳酸钙的方法相比,微生物转化法具有能耗低、不产生废液和废气,以及生产成本较低的优点[7]。

国内有许多研究者已经开展了以鸡蛋壳为原料通过微生物发酵的方式制备乳酸钙的研究,苏亮等[8]优化了使用鼠李糖杆菌发酵鸡蛋壳制备乳酸钙的发酵工艺,使发酵液中的乳酸钙质量浓度达到了89.68 g/L。黄翔等[9]使用了4种乳酸菌发酵鸡蛋壳制备乳酸钙,其乳酸钙质量浓度达40.01 g/L。也有研究者选择以鸭蛋壳为原料制备乳酸钙,胡波平[10]优化了使用乳酸杆菌发酵鸭蛋壳粉制备乳酸钙的发酵工艺,使鸭蛋壳的转化率达到了93.03%。目前有关发酵蛋壳制备乳酸钙的研究大都采用了液体发酵的方式,以固体发酵的方式制备乳酸钙的研究较为少见。相较于液体发酵,固体发酵可节约大量的水资源,也可以减少发酵时对环境造成的污染,同时固体发酵相较于液体发酵所需要的设备更少,对能源的消耗量更低,可以进一步降低生产成本[11]。此外,由于枯草芽孢杆菌能够分泌多种酶,产生枯草菌素、多黏菌素、制霉菌素和短杆菌肽等多种抗菌物质,在固体发酵时使用枯草芽孢杆菌不仅可以帮助降解发酵培养基中的大分子物质,也可以进一步降低发酵培养基被污染的概率[12]。笔者使用实验室保藏的嗜酸小球菌和枯草芽孢杆菌进行复合菌发酵蛋壳粉实验,根据实验室前期的实验结果,将嗜酸小球菌和枯草芽孢杆菌的接种体积比设置为2∶1,以发酵产物中乳酸钙的质量分数为指标优化发酵工艺,以期为使用微生物进行固体发酵生产蛋壳源乳酸钙提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌 种

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),嗜酸小球菌(Pediococcusacidilactici)。

1.1.2 主要试剂与原料

NaCl,无水乙酸钠,KH2PO4,K2HPO4,葡萄糖,钙试剂羧酸钠盐,EDTA,NaOH,蛋白胨,胰蛋白胨,酵母粉,豆粕,蛋壳粉(将收集来的鸡蛋壳去除内膜后粉碎获得)。

1.1.3 培养基及其他试剂配制方法

MRS液体培养基:葡萄糖6 g,K2HPO40.3 g,无水乙酸钠2 g,酵母提取粉0.8 g,蛋白胨1.2 g,超纯水200 mL。待培养基成分充分溶解后,将配制好的培养基放置于灭菌锅中于115 ℃灭菌30 min,待培养基冷却至室温后留作备用。

LB液体培养基:胰蛋白胨2 g,酵母提取粉1 g,氯化钠2 g,超纯水200 mL。待培养基成分充分溶解后,将配制好的培养基放置于灭菌锅中于115 ℃灭菌30 min,待培养基冷却至室温后留作备用。

钙试剂羧酸钠指示剂:称取钙试剂羧酸钠盐0.1 g,加入约110 ℃干燥过的氯化钠10 g,研磨并混匀。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化

在先前配制好的MRS液体培养基中接种嗜酸小球菌,放置于培养箱中,在温度为37 ℃条件下培养16 h,按1%的接种量活化2次。

在先前配制好的LB液体培养基中接种枯草芽孢杆菌,放置于摇床中,在温度为37 ℃,转速为130 r/min条件下培养16 h,按1%的接种量活化2次。

1.2.2 发酵产物中乳酸钙质量分数的测定方法

精确称取0.3 g烘干后的发酵产物,使用50 mL超纯水充分溶解,加入5 mL质量浓度为100 g/L的氢氧化钠溶液与0.1 g钙试剂羧酸钠指示剂，使用浓度为0.05 mol/L的EDTA溶液进行滴定,记录EDTA溶液的消耗量,单位为mL。发酵产物中乳酸钙质量分数计算式为

ω1=v1c1×0.727 4×100%

式中:v1为滴定时消耗的EDTA溶液的体积;c1为EDTA溶液的浓度;0.727 4为计算系数。

1.2.3 发酵单因素实验

1) 蛋壳粉添加量

以50 g豆粕为发酵基质,蛋壳粉添加量分别为2%,4%,6%,8%,10%,葡萄糖添加量为10%,NaCl添加量为3%,无水乙酸钠添加量为0.5%,KH2PO4添加量为0.2%,嗜酸小球菌和枯草芽孢杆菌的接种体积比为2∶1,接种量为24%,发酵基质含水量为50%,在37 ℃条件下发酵120 h后烘干,并测定乳酸钙的质量分数。

2) 葡萄糖添加量

以50 g豆粕为发酵基质,葡萄糖添加量分别为2%,5%,8%,11%,14%,蛋壳粉添加量为8%,NaCl添加量为3%,无水乙酸钠添加量为0.5%,KH2PO4添加量为0.2%,嗜酸小球菌和枯草芽孢杆菌的接种体积比为2∶1,接种量为24%,发酵基质含水量为50%,在37 ℃条件下发酵120 h后烘干,并测定乳酸钙的质量分数。

3) 含 水 量

以50 g豆粕为发酵基质,发酵基质含水量分别为20%,30%,40%,50%,60%,葡萄糖添加量为5%,蛋壳粉添加量为8%,NaCl添加量为3%,无水乙酸钠添加量为0.5%,KH2PO4添加量为0.2%,嗜酸小球菌和枯草芽孢杆菌的接种体积比为2∶1,接种量为24%,在37 ℃条件下发酵120 h后烘干,并测定乳酸钙的质量分数。

4) 发酵时间

以50 g豆粕为发酵基质,发酵时间分别为72,96,120,144,168 h,葡萄糖添加量为5%,蛋壳粉添加量为8%,NaCl添加量为3%,无水乙酸钠添加量为0.5%,KH2PO4添加量为0.2%,嗜酸小球菌和枯草芽孢杆菌的接种体积比为2∶1,接种量为24%,发酵基质含水量为50%,在37 ℃条件下发酵后烘干,并测定乳酸钙的质量分数。

5) 接 种 量

以50 g豆粕为发酵基质,接种量分别为6%,12%,18%,24%,30%,嗜酸小球菌和枯草芽孢杆菌的接种体积比为2∶1,葡萄糖添加量为5%,蛋壳粉添加量为8%,NaCl添加量为3%,无水乙酸钠添加量为0.5%,KH2PO4添加量为0.2%,发酵基质含水量为50%,在37 ℃条件下发酵96 h后烘干,并测定乳酸钙的质量分数。

2 结果与分析

2.1 蛋壳粉添加量对乳酸钙质量分数的影响

发酵产物中的乳酸钙是由乳酸与蛋壳中的碳酸钙反应所得,蛋壳粉添加量对乳酸钙质量分数的影响如图1所示。

图1 蛋壳粉添加量对乳酸钙质量分数的影响

由图1可以看出:当蛋壳粉添加量从2%逐渐增长到8%时,发酵产物中乳酸钙的质量分数从1.15%逐渐增加到4.48%;当蛋壳粉添加量为10%时,发酵产物中乳酸钙的质量分数反而下降到2.67%。这可能是因为：在实验中,乳酸菌分泌的乳酸会与添加的蛋壳粉反应,当蛋壳粉过多时,乳酸菌分泌的乳酸在与蛋壳粉反应生成乳酸钙后可能无法再使培养基的pH值进入适宜其生长的范围了。因此,在后续的实验中设置蛋壳粉添加量为8%。

2.2 葡萄糖添加量对乳酸钙质量分数的影响

葡萄糖是细菌产生乳酸的原料,也是其生长发育所需的重要碳源之一。当葡萄糖添加量较低时,增加葡萄糖可以使细菌分泌更多的乳酸并促进菌群的生长;当葡萄糖添加量过高时,过多的葡萄糖反而有可能抑制细菌利用其他非葡萄糖碳源,导致细菌的总产酸量下降。此外,过多的葡萄糖还会增加渗透压,导致细菌菌体失水,对细菌的代谢活动产生抑制作用,葡萄糖添加量对乳酸钙质量分数的影响如图2所示。

图2 葡萄糖添加量对乳酸钙质量分数的影响

由图2可以看出:当葡萄糖添加量从2%逐渐增加到14%时,乳酸钙的质量分数先上升后下降;当葡萄糖添加量为5%时,发酵产物中的乳酸钙质量分数最高,为5.55%。这可能是因为：当葡萄糖的添加量为5%时,既有益于细菌的生长发育,又不至于产生葡萄糖效应抑制细菌利用其他碳源,此时细菌的总产酸量达到了最大值。因此,在后续的发酵实验中设置葡萄糖添加量为5%。

2.3 含水量对乳酸钙质量分数的影响

微生物的生长发育离不开水,细菌的各种代谢活动都需要水分子的参与。发酵培养基的含水量对乳酸钙质量分数的影响如图3所示。

图3 含水量对乳酸钙质量分数的影响

由图3可以看出:当发酵培养基的含水量为20%～60%时,乳酸钙质量分数随含水量的增加而增加;当发酵培养基的含水量为60%时,乳酸钙的质量分数最高。虽然含水量为60%时的乳酸钙质量分数更高,但是此时烘干发酵产物所需的时间相较于含水量为50%时烘干发酵产物所需的时间过长,从节约能源的角度考虑,在后续的发酵实验中设置含水量为50%。

2.4 发酵时间对乳酸钙质量分数的影响

如果发酵时间设置过短,培养基中的营养物质未完全消耗便结束发酵,将影响乳酸钙的产出;如果发酵时间设置过长,营养物质已被充分利用后仍不结束发酵,又将导致时间的浪费。发酵时间对乳酸钙质量分数的影响如图4所示。

图4 发酵时间对乳酸钙质量分数的影响

由图4可以看出:当发酵时间从72 h延长到96 h时,发酵产物中乳酸钙的质量分数有较大幅度的提升;当发酵时间达到96 h后,乳酸钙的质量分数几乎不再随发酵时间的增加而增加。这可能是因为：当发酵时间达到96 h后,营养物质已被大量消耗,这导致此后菌群的代谢活动维持在一个较低的水平,嗜酸小球菌所分泌的乳酸大幅减少,乳酸钙的产量无明显增加。因此,在后续发酵实验中设置发酵时间为96 h。

2.5 接种量对乳酸钙质量分数的影响

实验采用的发酵方式为固体生料发酵,发酵培养基中含有杂菌,接种量过低可能导致接种的细菌难以建立优势菌群,无法及时将环境调整到适宜菌群生长的状态,使细菌的增殖受到了抑制;接种量过高则可能使菌群在发酵初期便消耗了过多的营养,导致此后细菌繁殖速度变慢,菌体老化,产酸速度放慢,反而使得乳酸的总产量下降[13]。接种量对乳酸钙质量分数的影响如图5所示。

图5 接种量对乳酸钙质量分数的影响

由图5可以看出:当接种量从6%逐渐增加到18%时,乳酸钙的质量分数从4.36%增加到6.09%;当接种量逐渐增加到30%时,乳酸钙的质量分数反而又下降到4.64%。因此,将接种量设置为18%。

3 结 论

我国每年有大量的废弃鸡蛋壳被浪费,通过发酵废弃鸡蛋壳生产乳酸钙有望成为提高废弃鸡蛋壳利用率的一种途径。实验以发酵产物中乳酸钙的质量分数为指标,通过单因素实验优化了使用嗜酸小球菌和枯草芽孢杆菌固体发酵鸡蛋壳生产乳酸钙的发酵工艺。结果表明:在发酵温度为37 ℃,嗜酸小球菌和枯草芽孢杆菌的接种体积比为2∶1的条件下,最佳发酵工艺为蛋壳粉的添加量为8%,葡萄糖的添加量为5%,含水量为50%,发酵时间为96 h,接种量为18%,发酵产物中乳酸钙的质量分数达到了6.09%。笔者实验虽然为发酵蛋壳粉制备乳酸钙提供了一定的数据基础,但是所得到的数据不够完善,仍需要进行更深层次的研究,才能对发酵工艺进行进一步的优化。