探讨PCR 技术于检验沙门菌中的应用与进展

王小东

（四川省成都市青白江区疾病预防控制中心，四川 成都 610300）

0 引言

沙门菌是常见的革兰氏阴性菌，隶属肠道细菌科，会诱发多种血清感染，进而导致沙门菌病。沙门菌属于中毒病菌的一种，若误食发霉食物则会导致沙门菌中毒，且中毒食物多为蛋奶类与肉类。以上畜牧产品的营养元素丰富，会为沙门菌生长与繁殖提供便利条件。此外，沙门菌具有较强的生命力，其适应能力强，可在食物中存活数月。沙门菌所致的食物中毒可使牲畜以及人类共同患病，具有较强的传播性。沙门菌的常规检验技术为血清学实验，其检验周期长，检验流程过于繁琐，所以需要寻求高效且快速的新技术。在生物学技术的推动下，PCR技术得到广泛使用，其可以对沙门菌进行定量和定性检验，具有较完善的快速检验体系，检验敏感度高。

1 沙门菌概述

沙门菌主要依附在消化系统内，其抗原构成类似于革兰阴性杆菌，是消化系统疾病的主要致病菌[1]。沙门菌所导致的疾病主要有两类，第一类为急性肠胃炎，第二类为伤寒、副伤寒。有研究指出，因沙门菌诱发食物中毒的患者数量在我国食物中毒总人数中居于首位，其为食物中毒最常见的细菌[2]。在食物中毒类别中，肉类的沙门菌含量最高，原因是其营养元素多，可促进沙门菌繁衍。若食物中所携带的沙门菌达到一定数量，则会造成人体感染。因此，感染的主要方式为食用沙门菌所污染的食物。

2 沙门菌常用检验技术

感染沙门菌后，需要采集被感染者的血液或者排泄物，而后将其作为样本进行致病菌检验[3]。临床病料以及食物安全检测的本质原理基本一致，但食物安全检测的制约因素较多，可能因食物本身的物质构成影响检验准确率，且食物可能受到多种致病菌侵袭，或是食物通过人工处理被外界因素影响，这都会损伤沙门菌，也可能导致沙门菌死亡，进而干扰检验结果。此外，临床病料内的沙门菌含量与食物安全检测样本中的含量有所差别，临床病料含量远高于食物含量。常规检验方法需要提取被感染对象的体内表面抗原，利用生化反应等途径检出沙门菌，其反应过程比较繁琐，检验所需时间长，需要大量使用反应试剂，且检验灵敏度不高[4]。相比较而言，PCR技术是对常规检验技术的优化，可以缩短检验时间，精准检出目的基因的致病菌种类，实现快速检验。目前，PCR技术在沙门菌检验中的应用率较高，且检验效果备受认可。

3 聚合酶链式反应（pol ymer ase chain r eaction，PCR）检验技术概述

PCR技术的检验原理是采集特定DNA片段，利用PCR技术将DNA片段进行放大，即循环复制所提取的DNA片段，使少量DNA可以不断增多，最终检出致病菌。简而言之，DNA样本复制是PCR检验的核心特征。其检验过程是将单链DNA作为检验样本，在特定环境条件下，引物选择人工合成品，通过PCR技术增加样本数量。具体细分为如下3个步骤：①高温变性；②低温复性；③适温延伸。将以上步骤视作一个单位，以循环方式完成检验操作。在PCR实验期间，需要高度关注温度变化，原因是温度不适宜会使样本DNA中的聚合酶活性丧失，进而影响检验结果。因此，每次循环均需要予以补充、增活操作，保证检验结果有效。但PCR技术存在不足之处，如检验效率受人为因素制约，若操作人员技能有限，仪器参数调节不当则会降低检验精准度。PCR检验需要使用PCR仪器，其根据聚合酶衍生而来，可以合理控制检验温度，进而对DNA样本完成检验。PCR技术的典型特点是敏感度与特异度强，可精准且快速检验，且有较高的自动化程度。由于PCR技术能够实现快速检验，因此被积极用于多个领域，且在实际运用中整合多项技术，进而衍生出多种PCR检验技术。

4 PCR检验技术对于沙门菌的检测应用

4.1 常规PCR技术

常规PCR技术在设计引物时选择特定DNA目标样本，采取特异保守序列进行设计，可以扩增待检DNA样本，利用终产物的扩增反应定性或者定量分析样本，其检验敏感度较高，便于操作，检验难度一般[5]。但其存在检验不足，可能导致假阳性结果，或者引物不同也会影响检验结果的问题。所以，常规PCR技术需要进行专业且严谨的检验操作，根据相关标准开展检验工作，规避检验影响因素。在常规PCR检验时，可将沙门氏菌毒力基因（hilA）作为检验引物，扩增片段选择497by，可明显缩短检验耗时，同时可以保证检验敏感度与准确率。也可将沙门菌属（inv A）基因作为目的基因，经PCR检验48h后可获取检验结果。研究样品选择加工鸡肉或者生肉，在样品上人工培养沙门菌，此时的PCR检验结果与BAx（r）系统的检验结果基本一致，准确率可达99%以上。虽然常规PCR的检验速度快，可操作性强，但难以区分细菌有无活性，进而降低食物中毒的检出率。原因是活性细菌被认为是食物中毒的主要致病菌，检出活性细菌可以综合判断沙门菌感染情况。此外，常规PCR技术容易出现样本污染情况，进而影响致病菌检出效果。不过目前PCR检验技术水平提升，可以消除污染因素。

4.2 多重PCR技术

相比于常规PCR技术，多重PCR的优势为将1对引物增多至2对及以上，能够强化DNA反应。多重PCR技术与常规PCR的检验一致性较高，更具高效性和便利性，且检验成本低。多重PCR技术被广泛用于沙门菌等检验工作中，可增快检验速度。但其同样具有检验劣势，如检验效率一般、敏感度不高等。因此，多重PCR技术需要突破现阶段的检验条件，优化排查检验影响因素，进而建立PCR反应体系。李师莹等[6]研究中，鉴定沙门菌血清型，选择鼠伤寒沙门菌（Stm4495）、inv A和鸡白痢沙门菌（SPUL-2693）作为引物，通过标准菌株-优化体系建立四重PCR检验流程。结果可见四重PCR的敏感度与特异度较佳，能够检出以上3种沙门菌，为快速检验提供新型技术支持。

4.3 实时荧光定量PCR技术（fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）

FQ-PCR技术最早于1996年被提出，是在常规的PCR反应体系内加入荧光基团，通过荧光信号实时评估PCR技术的反应过程。该技术是指对目的基因以及标准曲线进行定量分析，而后完成致病菌检验操作。该技术从常规PCR的定性检验延伸至定性、定量同时检验，其优势为减少PCR标本受污染的情况，具有更高的检验特异度和自动化程度，是现阶段沙门菌检验的常用技术。此外，FQ-PCR的优势之一为多种抗原联合检验，可将VI抗原基因或者H抗原基因等多种抗原作为引物，以PCR扩增方式检验伤寒沙门菌，其对于基因扩增的敏感度高，可以明显提升伤寒疾病的检出率，进而指导医生疾病的早期诊断与治疗工作。FQ-PCR技术可以有效且快速地检出特定样本内的沙门菌，其敏感度可达10cfu/g，检验时间约是4-10h，且获得的检验结果比较精准。以往研究将实验细菌或者食物作为目标样本，利用FQPCR技术进行检验，发现其检验敏感度达到102cfu/ml，结果获取时间在24h内，说明FQPCR技术使得沙门菌检验手段更具科学性和专业性。目前，相关研究细致分析FQ-PCR检验所需环境条件和FQ-PCR技术特征，通过编码方式确定实验目标，并整合实验引物需求，进而建立新型检验方法，证实通过其他物质性质的分析，能够反映沙门菌特征，而适当调节温度可以有效识别细菌种类。基于以上技术前提，使用FQ-PCR技术检验畜牧产品中的沙门菌含量，通过对两种肉类样本的检验发现，FQ-PCR的检验敏感度约是12cfu/25g，检验周期在10h内，且检验流程快捷、便利，具有较高的检验特异度。但需注意的是，FQ-PCR技术的成本较高，对于检验设备的功能要求较高，这是影响其推广使用的制约性因素之一。田赛[7]研究中通过FQ-PCR技术检验沙门菌，样本选择海鲜与粪便，结合omp F基因序列科学化设计引物，建立FQ-PCR检验方法，并分析该技术的敏感度、特异度与稳定性。结果显示，FQ-PCR技术能够扩增沙门菌多个型别的基因组DNA，不扩增非沙门菌病菌的基因组DNA，特异度良好。其对于阳性质粒模板的实际敏感度是0.1ng/L，而对于菌株基因组DNA的实际敏感度是10CFU/ml，能够在短时间检出沙门菌阳性菌株。此外，FQ-PCR的重复性比较强，经过5次反复试验后，Ct值变异系数不超过0.8%，证明FQ-PCR技术的敏感度、特异度高，且有良好稳定性，可以用于沙门菌的相关检验工作。

4.4 免疫捕捉PCR技术

免疫捕捉PCR是将PCR扩增技术有效整合于免疫捕捉技术，其检验对象是病原体，利用特异抗体有效捕捉抗原微生物，而后通过基因组序列引物开展PCR扩增操作，再通过检测扩增后的产物能够分析完整病原体信息，进而保证检验特异度。此外，在免疫捕捉与扩增过程中，样本体积会有所扩大，因此检验敏感度会随之提升。该技术可细分成以下步骤：第一，抗体固相化，在微量滴定板、琼脂糖凝胶颗粒或者ep p end orf管等固相载体表面包被特异抗体。第二，抗原捕捉，孵育样本和所包被的抗体，使其能够吸附抗原微生物，进而完成抗原捕捉操作。第三，制备模板，利用加热的方式促使DNA病毒释放出基因组DNA，利用逆转录制形式释放RNA病毒的基因组RAN，将c DNA用作模板。第四，PCR扩增，扩增反应借助特异引物完成，可以使用内外两对引物，通过套式PCR完成扩增操作，以此保证检验特异度。第五，检测扩增物，使用寡核苷酸探针以及琼脂糖凝胶电泳杂交等多种形式进行检验，分析扩增片段的序列。免疫捕捉技术具有操作简单且检验快速的优势，能够基本满足大规模样本的筛选需求，可以在短时间内检出样本中的沙门菌含量，可用于商品检验检疫、食品卫生检测、临床疾病诊断等多个领域。

4.5 免疫磁珠分离PCR（immunomagnetic bead separation PCR，IMS-PCR）技术

IMS-PCR最早于2009年被用于沙门菌的检验工作中，其操作便利性强，检验时间短，对于沙门菌的检出率高。IMS-PCR对于牛乳沙门菌的检验敏感度约是9cfu/ml，检验时间约是7h，能够显著提升沙门菌检验的时效性以及敏感度。IMS-PCR需对目标菌抗体与磁珠间进行包被处理，进而获得免疫磁珠，再结合于样本内目标菌的抗原抗体，最后通过磁场作用使食物基质内的目标菌被有效分离。该技术是对FQ-PCR以及免疫磁珠分离的高效整合，同时具备以上两种技术的检验优势，对于沙门菌的检验速度更快，准确度更高。但食物基质具有较高的复杂性，且食物种类不同，其检验条件以及食源性致病菌分布有所差异，需要合理选择检验方法，可以针对性开展检验工作，所以其检验技术要求高。现阶段，免疫磁珠分离FQ-PCR技术的使用范围较广，被用于鸡胸肉、猪肉以及牛奶等食物沙门菌检验工作中。目前，检验过程中不断优化免疫磁珠使用量和样本菌液具体的反应时间，选取典型性的沙门菌，可以提高免疫磁珠的检验特异度，增强其捕获能力。此外，将ttr沙门菌基因作为靶基因，有效构建FQ-PCR体系能够优化沙门菌免疫磁珠分离FQ-PCR检验技术，显著缩短检验所需时间，是沙门菌检验的高效手段。李亚茹等[8]研究中采取免疫磁珠分离联合FQ-PCR检验技术，对虾中的沙门菌进行检验，免疫磁珠由抗沙门菌多克隆抗体以及纳米磁珠进行制备，对反应条件进行适度优化，利用Ⅱ订S法进行检验，引物为沙门菌舸基因，建立检验体系。选择沙门菌4株进行检验，评估敏感度与特异度。结果可见免疫磁珠添加量的最合理用量是100皿，样本菌液以及免疫磁珠的反应最佳时间是30min，该技术对于虾内部沙门菌的检出率高，检验时间短于6h。证实免疫磁珠分离联合FQ-PCR能够预防沙门菌所致的食源性疾病，在沙门菌检验中的可行性高。

综上，在沙门菌检验技术中，PCR技术的操作便利，检验结果准确且高效[9-13]，是现阶段应用比较广泛的检验技术之一。相比于常规检验技术，PCR技术的优势明显，尤其是FQPCR、免疫捕捉PCR技术与IMS-PCR技术不仅能缩短检验耗时，还能提升检验准确度。虽然以上PCR检验技术仍存在不足之处，但其在卫生学评价以及多种疾病的临床诊断中占据重要地位。在未来研究中，可积极引入新技术与先进科技，不断优化PCR对于沙门菌的检验技术[14-16]，并突破PCR检验过程中的环境条件约束，提高PCR技术的适用性。