基于数据挖掘和网络药理学探究治疗跌打损伤的用药规律及其作用机制

邹福贤，周晓兰，温秀萍

(1.福建中医药大学附属泉州市正骨医院，福建 泉州 362000；2.福建中医药大学药学院，福建 福州 350000)

唐代《外台秘要》将损伤分为两种，一者外损，一者内伤；其中外损属于中医“伤筋”范畴，现代称之为软组织损伤，主要指人体关节周围组织、肌肉遭受外来暴力撞击、强力扭转或牵拉等因素引起[1]。西医治疗软组织损伤主要依靠一些抗炎药，起到抗炎止痛的作用，但是其副作用比较明显，如可能合成类固醇，影响人体正常激素水平。中医在治疗外损方面具有较多的相关文献记载，虽然近年来也有部分学者对某一著作，如《跌打大全》[2]、《四部医典》[3]、《中国药典》[4]以及少数民族医药[5]等进行跌打损伤用药规律分析，这些研究对于各代名医的传承无疑具有重要意义，但是现有研究尚缺乏对历代所有方剂中治疗跌打损伤用药规律的综合研究，也尚未有对内服药和外用药进行比对的研究，并且关于软组织损伤治疗机制的研究也较少，有待深入挖掘。《中医方剂大辞典》是对所有从古至今名方的汇总，收方约10万首，内容全面，因此为深入分析古人治疗跌打损伤的用药规律，探讨治疗跌打损伤的新思路和方法，本研究采用古今医案云平台(V2.3.5)从中药组成、中药性味、归经、四气五味等角度进行统计分析、关联分析、复杂网络分析，探究《中医方剂大辞典》中治疗外损的用药规律，并结合网络药理学阐明其作用机制，为临床治疗提供数据支撑。

1 资料与方法

1.1 资料来源与纳入标准

以“软组织”“跌损”“跌仆”“跌扑”“跌打”“闪跌”“伤损”“损伤”“扑损”“仆损”“打扑”“打仆”“伤筋”“挫伤”“挫闪”“闪挫”“扭伤”和“折伤”等为关键词，对《中医方剂大辞典》中所有方剂的功效主治进行筛选，并将该方剂导入到跌打损伤数据库。

1.2 排除标准

①排除方剂的主治中包含上述关键词，但并非治疗跌打损伤的方剂，如五脏虚劳损伤、产前产后伤损、眼目伤损等；②排除仅有功效主治但无中药组成的方剂；③排除药物组成相同的方剂。

1.3 数据规范化

参考《中国药典(2020版)》和《中药大辞典》中的药材名，对部分异名进行规范化订正，如朴硝修改为芒硝、西黄改为牛黄、当门子改为麝香等；其中难以考证者，保留其原名。采用双人单独数据规范化修订，并比较两人修订的异同，然后进一步修订。

1.4 数据录入和分析

将修订后的数据导入古今医案云平台中，通过数据挖掘模块进行药物频次统计、药性分析、规则关联分析。

2 结果

2.1 处方纳入情况

通过筛选，初步筛选出1 254首方剂，比对排除标准，逐一检查后，剩余1 027首用于治疗跌打损伤的方剂，其中涉及药物976味。

2.2 处方出处分析

对1 027首方剂的出处进行统计，所涉及古今医书209本，主要来自明、宋、清三个时期编撰的医学古籍。收载最多的为《普济方》，《普济方》全书有6万余首方剂，是我国现存最大的古代方书，其中跌打损伤相关方剂76首；《圣济总录》收载方剂近2万首，为北宋时期搜方较多的医学全书，其中跌打损伤相关方剂60首。见表1。

表1 跌打损伤方剂主要出处

2.3 处方剂型分析

跌打损伤为外伤，其治疗方式主要有外用和内服两种，涉及用药剂型主要有散剂、膏剂、汤剂、丹、丸剂、酒剂以及其他剂型，如酊剂、片剂和贴剂等。内服药占整个跌打损伤药的61%，主要为散剂、汤剂和丹剂，而外用药主要为膏剂和散剂。见表2。

表2 跌打损伤方剂剂型频数

2.4 药物频次统计

对药物频次进行分析后，发现近一半的方剂中都含有当归，其次超过1/3的方剂含有乳香和没药，其他药物如白芷、川芎、甘草、赤芍、大黄、红花、血竭等频次均超过15%，见表3和图1。内服药和外用药之间的药物频次存在一定的差异，两种治疗方法中出现频次均较高的有当归、乳香、没药、赤芍和白芷，其中内服方剂中当归出现的频次远远高于其他药物，而在外用方剂中的频次略高于其他药物，另外白芷在外用方剂中出现的频次较内服方剂有显著提升。不同之处在于内服方剂中还高频率使用了甘草以及川芎、红花、血竭、自然铜等活血化瘀药物；而外用方剂则高频率使用了大黄以及草乌、川乌、防风、羌活等祛风止痛药物。

表3 跌打损伤内服方剂和外用方剂药物频次

2.5 药物四气、五味统计

在所有的药物组成中，四气统计将大热归属于热，大寒、微寒均归属于寒，微温归属于温，结果发现温性药和平性药占绝大多数；在五味统计中，涩味归属于酸，淡味归属于甘，据此统计出辛、苦味药物最多，而酸、咸味药物最少。见表4。

图1 跌打损伤方剂的药物频次

表4 跌打损伤方剂中所有药物的四气五味频次

2.6 药物性味归经统计

对所有药物的归经进行统计，发现内服药和外用药在归经上并无太大差异，所有药物大多数入肝经，其次为入脾经和心经。见表5。

表5 跌打损伤方剂中所有药物的归经频

2.7 药物关联度分析

对方剂中含有的药物组合出现的频次进行分析，以发现药物之间的关系。筛选出置信度(同时包含两种药的方剂在所有包含其中一种药物的方剂中的占比)超过0.8的，其对应的提升度均大于1，说明药物之间正相关性越强。乳香-没药、乳香-血竭、没药-血竭、当归-赤芍、当归-川芎和当归-羌活药对无论在内服方剂还是在外用方剂中关联性都非常高，在内服方剂中，当归与红花、桃仁、生地、肉桂的关联性较高，而在外用方剂中当归还与独活和续断的关联度较高，另一个较大的差异是外用方剂中川乌-草乌、荆芥-防风常配伍使用，见表6、表7和图2。因此内服方剂核心药组为当归、川芎、羌活、红花、赤芍、生地、桃仁、肉桂、乳香、没药和血竭；外用方剂核心药组为当归、川芎、羌活、赤芍、独续断、乳香、没药、血竭、川乌、草乌、荆芥和防风。

表6 内服方剂中药物关联性分析

表7 外用方剂中药物关联性分析

2.8 聚类分析

采用欧式距离法筛选前20个药物进行聚类分析，见图3。可将内服方剂核心药物组分为三类：第一类为当归；第二类为乳香、没药、血竭、自然铜和骨碎补等，剩余的甘草、大黄、苏木、红花等14中药为第三类。外用方剂同样可分为三类：第一类为血竭、乳香和没药；第二类为当归和白芷；第三类为木鳖子、白及、赤芍、肉桂和大黄等15味中药。

2.9 内服方剂作用机制分析

2.9.1 内服方剂核心药组-有效成分-靶点网络 采用中药系统药理学数据库与分析平台(TC-FMSP)获取核心药组的化学成分和相应的作用靶点。根据化学成分的药动学参数按口服生物利用度OB≥30%且类药性DL≥0.18为筛选有效成分的条件；然后检索TCMSP数据库有效成分的作用靶点，并利用Uniprot数据库将靶点名称标准化。疾病的靶点在GeneCards数据库和CTD数据库中以关键词“Soft Tissue Injury”进行查找，并与有效成分对应的靶点取交集。结果除血竭和肉桂外检索到9味中药中符合上述条件的共有137个有效成分，并获取到65个作用靶点(其中43个成分未检索到靶点)。利用Cytoscape 3.2.1软件构建“核心药组-有效成分-靶点网络图”，见图4。中药中自由度较高的为没药、乳香、桃仁、红花和羌活，当归和生地的自由度较低；有效成分的平均自由度为4.3，自由度超过2倍平均值的有效成分有21个，见表8；靶点的平均自由度为6.6，自由度超过2倍平均值的靶点分别为PTGS2、NOCA2、PGR、HSP90AA1、NR3C2和GABRA1。

注：橙色：内服方剂；蓝色：外用方剂；线上数值：共现度。

图3 内服方剂(A)及外用方剂(B)排名前20的药物聚类

注：圆形代表中药；菱形代表有效成分；“V”形代表靶点。

表8 内服方剂核心药组有效成分

2.9.2 GO富集分析和KEGG通路分析 将“2.9.1”项下获取的靶点，应用R语言软件中的BiocManager包进行GO富集分析和KEGG通路分析。以GO富集条目中的FDR<0.05为筛选显著富集的GO条目条件，结果生物过程(BP)具有986条，细胞成分(CC)有40条，分子功能(MF)有103条，每个项目排名前10的条目，见图5；其中BP包括对类固醇激素的反应(response to steroid hormone)、循环系统中的血管过程(vascular process in circulatory system)和细胞对药物的反应(cellular response to drug)等；CC主要与突触膜有关，如integral component of postsynaptic membrane、intrinsic component of postsynaptic membrane和integral component of synaptic membrane等；MF包括G蛋白偶联胺受体活性(G protein-coupled amine receptor activity)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)和儿茶酚胺结合(catecholamine binding)等。KEGG通路富集分析同样以FDR<0.05为筛选条件，获得105条具有显著富集的通路，排名较前的通路主要为脂质和动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、神经活性配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)和化学致癌作用-受体激活(Chemical carcinogenesis-receptor)等，见图6。

3 讨论

《伤科补要》记载：“夫跌打损伤，坠堕磕之证，专从血论。或有瘀血停积，或为亡血过多，然后施治……先逐其瘀，而后和营止痛，自无不效。”此外《内经》云∶“形伤则痛，气伤则肿。”又曰∶“先肿而后痛者，形伤气也；先痛而后肿者，气伤形也。凡打扑闪错……致气血凝结者，宜活血顺气之法。”因此跌打损伤的治法以活血止痛行气为主，并要进行及时治疗。本研究通过对1 027首方剂的药物组成进行分析，发现活血类药物当归、乳香、没药、白芷、川芎、甘草、赤芍、大黄、红花和血竭等使用频次较高；而李彦民等[2]对《跌打大全》中的81首治疗跌打损伤的方剂进行分析，排序在前10位的药物分别是没药、乳香、生地、甘草、当归、赤芍、红花、防风、三七、木香；《邹伯奇家传手抄本》中94首治疗跌打损伤方剂中使用频率较高的有当归、乳香、没药、红花、地黄、桃仁、大黄、血竭、三七和赤芍等[6]；2015版《中国药典》用于跌打损伤的29首方剂中主要使用的药物有乳香、没药、冰片、当归、红花、大黄、土鳖虫、血竭、三七和白芷等[4]。综上分析，小样本的方剂研究与本研究结果类似，治疗跌打损伤的药物以活血止痛为主，主要有没药、乳香、当归、红花、血竭、赤芍、大黄和三七等，这与中医古籍记载的理论相符合。

图5 内服方剂核心药组的GO富集分析

图6 KEGG通路分析气泡图

通过对跌打损伤方剂中药物归经分析，发现主要入肝、脾和心经，而2015版《中国药典》关于跌打损伤的方剂同样表明此结论[4]。《伤科补要》载：“跌打损伤之证，恶血留内，则不分何经，皆以肝为主。”肝藏血，心行之，人动则血运于诸经、人静则血归于肝脏，五脏六腑之血全赖脾气统摄，这三个脏腑与血液的化生、运行具有较大的关系；此外治疗跌打损伤的药物多性辛、温，味苦、辛能散能行，能够发散、行血行气，具有活血化瘀的功效，使血液流畅。运用网络药理学构建“药性组合-中药作用靶标-生物网络模块-功效”网络图，发现辛温药物与化瘀散结的功效相关，而苦味与炎症相关，体现了苦可宣泄瘀散的功效，其药物主要通过调节不同靶点参与血小板脱粒、血液凝固、血小板活化等过程，从而发挥活血化瘀的功效[7-8]。

通过关联分析可以找出治疗跌打损伤的常用药对，无论内服还是外用，乳香-没药的支持度和置信度均较高，在《跌打大全》中同样如此[2]。现代药理学研究表明，乳香、没药具有抗炎[9]、镇痛[10]等作用，此外乳香、没药的挥发油可能增加皮肤血流量促进川芎等药物的渗透[11]，说明乳香、没药作为外用药时具有重要的作用，并且蔡煜林等通过对文献报道中的140个治疗扭伤外用膏剂处方进行分析，发现其核心药物为乳香、没药、大黄[12]，因此乳香-没药是治疗跌打损伤不可或缺的一组药对。此外，其他关联度较高的药对基本与当归有关，这与其他小样本数据研究结果基本一致[2，4，6]，如当归-川芎、当归-赤芍、当归-生地等。软组织损伤的主要病机是气血瘀滞不通，而当归能行血中之气，使血各归其经，药理研究表明其具有改善外周循环、减少血管阻力、减少血栓、增加血红蛋白等作用[13]。当归∶川芎的比例为4∶1～2∶1时，其养血补血效果随着剂量的增加而增加[14]，该药对还具有抗血栓、降低全血黏度、提升血红细胞数等作用[15]。在外用方剂中，川乌-草乌、荆芥-防风药对的使用频次也较高，虽然川乌-草乌两者均具有较大毒性，但在外用时，其安全性得到一定的保证，并且其改善血液循环、抗炎止痛的效果也较为显著[16-17]，配伍荆芥-防风能够逐风邪、散寒湿。

关于治疗软组织损伤的作用机制研究目前大多数集中在TLR2/NF-κB信号通路中，与肿瘤坏死因子TNF、白细胞介素IL和前列腺素PGE等有关[18-19]。王伟军等[20]和杨威等[21]分别开展的桃红四物汤和701跌打镇痛膏治疗软组织损伤的研究也对此进行了验证，发现其主要通过降低CASP3、NFKB1和PTGS2的蛋白表达发挥抗炎、抗氧化应激作用，从而收到治疗效果。上述研究结果与本研究核心药组预测的靶点和KEGG富集的通路基本一致，少数差异可能是由于药物组成不同导致的，或者存在新的治疗软组织损伤的作用靶点和通路，有待进一步实验验证。

本研究运用古今医案云平台，对《方剂大辞典》中1 027首治疗跌打损伤的方剂进行数据挖掘，发现内服方剂核心药组和外用方剂核心药组，并结合网络药理学分析阐明内服方剂的核心药组潜在的作用机制——以多种有效成分通过PTGS2、NCOA2、PGR等靶点作用于脂质和动脉粥样硬化、IL-17、神经活性配体-受体相互作用等多条通路，从而发挥治疗作用，但其具体机制还需进一步实验验证。本研究可为治疗软组织损伤机制研究提供一定的理论依据，为临床治疗跌打损伤提供参考。