高效液相色谱法同时测定粳米中D(-)-抗坏血酸和L(+)-抗坏血酸的方法优化

曾雪仪

（肇庆市食品检验所，广东肇庆 526000）

抗坏血酸是人体必不可缺的微量营养元素之一，它不仅广泛参加机体的多项生命活动，还有助于增强免疫力、抗衰老、抵御心血管疾病和动脉硬化[1-2]。抗坏血酸主要以D(-)-抗坏血酸和L(+)-抗坏血酸两种形式存在。L(+)-抗坏血酸，又称为维生素C，对人体具有生命活性；D(-)-抗坏血酸，是L(+)-抗坏血酸的光学异构体，对人体基本没有生物活性，且摄入过多会导致白细胞抵抗病毒的能力下降，甚至出现腹泻、尿酸结石、皮疹等病症[3]。人体无法自动合成抗坏血酸，只能从食物中获取，因此研究定量检测食品中的抗坏血酸，对于食品安全和人体健康意义重大[4]。

目前检测抗坏血酸的方法有2,6-二氯靛酚滴定法[5]、电化学法[6]、原子吸收光谱法[7]及高效液相色谱法[8]等。相比于其他方法，高效液相色谱法具有高灵敏度、高稳定性、高分离效率等优点，被广泛用于抗坏血酸的检测。现行国家标准《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》（GB 5009.86—2016）[9]提供了高效液相色谱法测定食品中抗坏血酸的方法，但该方法用于检测谷物中的抗坏血酸回收效率低，且使用表面活性剂作为流动相，致使基线不稳定，容易出现峰漂移现象。因此，本研究选择无表面活性剂且配制方式更为简单的0.1%磷酸∶甲醇=98∶2 作为流动相，采用冰浴且二次超声的方式来提高提取效率，为高效地测定谷物中抗坏血酸含量提供准确、可靠的分析手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L(+)- 抗坏血酸、D(-)- 抗坏血酸（99.9%，Stanford）；偏磷酸、L-半胱氨酸、磷酸三钠、磷酸（分析纯，广州化学试剂厂）；磷酸二氢钾、十六烷基三甲基溴化铵（分析纯，南京化学试剂有限公司）；粳米（市售）；实验用水为一级水。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity II），配备二极管阵列检测器（Agilent G7115A）；pH 计（PHSJ-4F，雷磁）；台式数控超声波清洗机（KQ-300DA，昆山舒美超声仪器有限公司）；超纯水机（comfort II，德国赛多利斯）。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

称取1.5 g 粳米样品于50 mL 离心管中，加入25 mL 20 g·L-1的偏磷酸，摇匀，浸泡30 min，冰浴超声15 min，于8 000 r·min-1离心5 min，上清液转移至50 mL 棕色容量瓶，用25 mL 20 g·L-1的偏磷酸重复提取1 遍并转移至容量瓶，最终用20 g·L-1的偏磷酸定容至50 mL。吸取上述溶液约2 mL 过0.45 μm 的水相滤膜，上机检测抗坏血酸的两种异构体含量。移取定容后的上清液20 mL，加入10 mL 浓度为40 g·L-1的L-半胱氨酸溶液，先用浓度为100 g·L-1的磷酸三钠把pH 值调至7.0～7.2，再用磷酸调节pH 值至2.5～2.8，最后用偏磷酸定容至50 mL 刻度线，混合均匀后，过0.45 μm 的水相滤膜，上机，测得粳米样品中包括脱氢型的L（+）-抗坏血酸的总量（整个实验在避光条件下进行）。

1.3.2 标准溶液配制

准确称取L（+）-抗坏血酸和D（-）-抗坏血酸标准品各0.01 g，用20 g·L-1的偏磷酸定容至10 mL，得到1.000 mg·mL-1的混合标准储备液。用偏磷酸稀释到特定的系列标准曲线浓度。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：月旭AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：245 nm；进样量：20 μL；流动相：0.1%磷酸∶甲醇=98∶2；流速：0.7 mL·min-1。

2 结果与分析

2.1 前处理方式的优化

2.1.1 提取溶剂的选择

抗坏血酸具有较强的还原性，容易受到光照和温度的影响，且在中性和碱性条件下稳定性差，但在酸性环境中相对稳定。因此，本实验研究了0.1 mol·L-1草酸、0.1%盐酸、0.1 mol·L-1磷酸和20 g·L-1的偏磷酸作为提取溶剂，使用粳米样品，分别做添加回收率实验。实验结果如图1所示，相比于其他提取溶剂，用20 g·L-1的偏磷酸作为提取溶剂具有较高的回收率。因此，选取20 g·L-1的偏磷酸作为提取溶剂。

图1 不同提取溶剂对回收率的影响图

2.1.2 提取方式的选择

为研究不同提取方式对粳米样品提取效率的影响，在优化提取溶剂的条件下，研究了不同提取条件（超声5 min、超声15 min、超声25 min、冰浴超声15 min 和浸泡30 min+冰浴超声15 min）对提取效率的影响，实验结果见图2。结果显示，超声5 min ＜超声25 min ＜超声15 min ＜冰浴超声15 min ＜浸泡30 min+冰浴超声15 min，表明先用20 g·L-1的偏磷酸浸泡30 min 使偏磷酸先充分渗透粳米样品，以便于更好地提取抗坏血酸，且冰浴条件有稳定抗坏血酸的作用。因此，选择先用20 g·L-1的偏磷酸浸泡30 min，再冰浴超声15 min 的提取方式，得到良好的提取效率。

图2 不同提取方式对反应的影响图

2.1.3 提取次数的选择

在优化条件后，分别对同一批次粳米进行了3次提取并测定抗坏血酸的含量。由图3知，2 次提取高于1 次提取，但2 次与3 次提取结果相差不大，因此本实验选择2 次提取的方式。

图3 提取次数对实验的影响图

2.2 流动相的选择

现有的国家标准采用的流动相含有十六烷基三甲基溴化铵，而十六烷基三甲基溴化铵是一种表面活性剂，易产生气泡，致使基线不稳定，容易出现峰漂移现象，对被分析物的定性和定量带来影响，且长时间使用会降低色谱柱的性能[10]。本实验选用无表面活性剂且配制方式更简单的0.1%磷酸∶甲醇=98∶2 作为流动相，得到良好的分离效果（图4），同时实现基线和保留时间稳定。

图4 L（+）-抗坏血酸、D（-）-抗坏血酸的标准色谱图

2.3 线性方程、方法检出限和定量限

配制系列浓度为0.5 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、25.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1的标准混合工作液，在最优条件下，上机采集信号。以峰面积（Y）对浓度（X）作图。结果显示，在0.5～50.0 μg·mL-1，Y与X呈现良好的线性关系，相关系数均为0.999 96。L（+）-抗坏血酸的线性方程为Y=93.2X+1.42，D（-）-抗坏血酸的线性方程为Y=98.9X+1.06。

与国家标准方法（GB 5009.86—2016）相比（表1），本实验方法具有更低的检出限和定量限。

表1 线性范围、检出限、定量限

2.4 回收率和精密度

采用在阴性粳米样品中加标的方法来测定回收率和精密度。取同一批次的阴性粳米样品6 份进行加标实验，加入混合标准液，使抗坏血酸异构体的上机最终浓度分别为5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、50 μg·mL-1，每个加标浓度做3 个平行，取平均值。结果如表2所示，L（+）-抗坏血酸的回收率为96.0%～99.8%，相对标准偏差为0.65%～1.00%；D（-）-抗坏血酸的回收率为98.8%～101.6%，相对标准偏差为0.68%～1.21%。

表2 L（+）-抗坏血酸、D（-）-抗坏血酸的回收率及精密度

2.5 本方法与国家标准方法的结果比较

选择同一批阴性粳米样品取6 份样品，各准确称取1.5 g，加入L（+）-抗坏血酸和D（-）-抗坏血酸混合标准液，使L（+）-抗坏血酸和D（-）-抗坏血酸上机的最终浓度均为10 μg·mL-1，分别按国家标准方法GB 5009.86—2016 和本方法进行前处理和上机测试，平行3 次。由表3看出，两种方法都能满足检测粳米中抗坏血酸的要求，而本方法采用先浸泡后两次提取的方式，对粳米中的抗坏血酸具有更高的提取效率；同时选取无表面活性剂的流动相，使检测结果精密度更高，定量更为准确。

表3 本方法与国家标准方法的对比

3 结论

本研究建立了一种利用高效液相色谱高回收率、快速灵敏地检测粳米中D(-)-抗坏血酸、L(+)-抗坏血酸和抗坏血酸总量的方法，基于冰浴且二次超声的提取方式，采用0.1%磷酸∶甲醇=98∶2 为流动相，实现绿色、稳定地同步检测粳米抗坏血酸。