真菌荧光染色在侵袭性真菌病中的应用价值

张澍雅 陈众博 虞亦鸣 庄起东 於学婵 陈辉 李安琪邓在春 郑琳

1.宁波大学医学院附属医院呼吸与危重症科，浙江宁波 315000；2.宁波大学医学院附属医院微生物室，浙江宁波 315000

近年来，侵袭性肺部真菌感染（invasive pulmonary fungal infection，IPFI）的发病率明显上升，免疫力低下的患者发病率更高[1,2]。同时IPFI 也日渐成为器官移植受者、恶性血液病和恶性肿瘤患者以及其他危重病患者的死亡原因之一[3,6]。IPFI 是由真菌直接侵犯(非寄生、过敏或毒素中毒)肺或支气管引起的急、慢性组织病理损害所导致的，及早诊断、及时治疗对提升疾病治愈率、降低死亡率相当重要。目前主要诊断方法包括微生物学检查（真菌直接镜检、真菌培养和鉴定、真菌血清学检查、分子生物学方法）和组织病理学检查，其中真菌直接镜检操作简便，可快速报告结果，具有重要的临床价值[7]。真菌免疫荧光染色是近年来新发展的一项直接镜检方法。既往研究表明真菌免疫荧光染色在浅表真菌感染诊断中具有重要临床价值[8-11]，但关于其在侵袭性真菌病诊断中的应用价值研究不多。本研究以IPFI为例，通过对高度怀疑IPFI 患者的肺泡灌洗液以及血液的检查结果进行收集、分析统计，评估真菌荧光染色在侵袭性真菌病中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2018 年1 月至2021 年12 月宁波大学医学院附属医院呼吸与危重症科收治的高度怀疑侵袭性肺部真菌感染的住院患者资料170 例，其中66 例患者怀疑曲霉菌感染，76 例患者怀疑隐球菌感染，28 例患者考虑其他真菌感染。纳入标准：①具有IPFI 高危因素、临床表现、影像学特征；②住院期间完成支气管镜检查，并采取肺泡灌洗液；③病例资料完整；④年龄≥18 岁。排除标准：①明确为细菌、真菌感染；②妊娠期、哺乳期；③静脉滴注白蛋白或免疫球蛋白者；④存在其他可能影响实验结果的因素。研究共收集患者资料170份，本研究征得患者知情同意，并经宁波大学医学院附属医院伦理委员会批准实施（伦理学审批号：KS20224012）。

1.2 标本采集

所有患者肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）均为支气管镜下采集，具体过程如下：患者无支气管镜检查禁忌，经口腔置入气管镜，在肺部病变部位进行灌洗，灌洗液为灭菌氯化钠注射液，每次30～50ml，连续灌洗3～4 次后进行回收，回收的灌洗液进行送检。

1.3 检验方法

1.3.1 真菌免疫荧光染色 取待测BALF 标本离心，弃上清液并充分混合沉淀物，取1 滴标本均匀涂在洁净载玻片上，滴加荧光染液1 滴，盖上盖玻片，静置1min 后镜检。结果判读：镜下看到亮蓝色真菌菌丝或孢子则判定为阳性，镜下未找到真菌菌丝或孢子则为阴性。

1.3.2 氢氧化钾湿片法 标本同免疫荧光染色处理后滴加1 滴10%氢氧化钾溶液，盖上盖玻片，酒精灯火焰上微加热后轻压盖玻片，使标本透明，显微镜下直接观察。若高倍镜下观察到真菌菌丝或孢子则判定为阳性。如果高倍镜下未找到真菌菌丝或孢子则判定为阴性。

1.3.3 革兰染色 标本同免疫荧光染色处理后取适量涂片，经过自然晾干、固定，应用革兰染片仪进行革兰染色，应用普通光学显微镜进行油镜下阅片。见到染成紫色的真菌孢子、真菌丝和假菌丝等真菌结构记录为阳性。

1.3.4 （1,3）-β-D 葡聚糖检测（G 试验）采集患者清晨空腹肘静脉血5ml，标本预处理后根据G 试验试剂盒说明书进行具体操作，试验结果以70pg/ml为阳性临界值。

1.3.5 半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）试验 BALF标本预处理后根据GM 试验试剂盒说明书进行具体操作，以待测标本的GM 指数≥0.5 为诊断界值。

1.3.6 隐球菌荚膜多糖抗原检测 BALF 标本预处理后按照隐球菌荚膜多糖抗原检测试剂盒（胶体金法）说明书进行具体操作。

1.4 IFPI 判定

参照欧洲癌症研究治疗组织、侵袭性真菌感染协作组等共同修订的诊断标准[12]，诊断结果分为确诊、拟诊、疑诊。在本研究中通过结合患者病史、临床症状体征、影像学表现、微生物检测结果等做出相应诊断。将确诊和拟诊作为真阳性，将疑诊及非IPFI 作为真阴性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件对数据进行处理分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用例数（百分比）[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床诊断结果

170 例患者中，临床确诊IPFI90 例，非IPFI80 例。IPFI 病原体分类及3 种检测方法所得结果，见表1。

表1 IFPI 病原体分类及检测结果[n（%）]

2.2 BALF 真菌直接镜检3 种方法阳性检出率比较

170 例BALF 标本分别进行免疫荧光染色、氢氧化钾湿片法、革兰染色，结果显示，免疫荧光染色的阳性检出率为34.7%，明显高于氢氧化钾湿片法的阳性检出率12.4%，差异有统计学意义（χ2=36.10，P＜0.001）；免疫荧光染色的阳性检出率为34.7%，高于革兰染色法检出率4.1%，差异有统计学意义（χ2=50.10，P＜0.001）。

2.3 免疫荧光染色与G 试验检测结果及诊断效能比较

170 例高度怀疑IPFI 患者中，有136 例同时进行了BALF 免疫荧光染色及血清G 试验。以临床诊断为标准，免疫荧光的敏感度高于血清G 试验，差异有统计学意义（χ2=16.50，P＜0.001），免疫荧光的特异性低于血清 G 试验，差异无统计学意义（χ2=1.20，P＞0.05），见表2。

表2 荧光染色和G 实验检测结果及诊断效能比较

2.4 真菌荧光染色在不同真菌类型感染中的诊断价值评估

170 例患者中，高度怀疑侵袭性曲霉病的66 例患者同时进行了BALF 免疫荧光染色以及GM 试验，结果显示，免疫荧光染色的敏感度高于GM 试验，差异有统计学意义（χ2=5.80，P＜0.05），免疫荧光染色的特异性高于GM 试验，差异有统计学意义（χ2=5.10，P＜0.05），见表3。

表3 免疫荧光染色和GM 实验检测结果及诊断效能比较

2.5 免疫荧光染色与隐球菌荚膜多糖抗原检测结果及诊断效能比较

对于高度怀疑隐球菌感染的76 例患者，进行隐球菌荚膜多糖抗原检测和BALF 免疫荧光染色。隐球菌荚膜多糖抗原检测显示阳性36 例，免疫荧光染色检测显示其中阳性11 例，阴性25 例；隐球菌荚膜多糖抗原检测显示阴性40 例，免疫荧光染色检测显示其中阳性2 例，阴性38 例。以临床诊断为标准，计算两种检测方法的敏感度、特异性、阳性预测值和阴性预测值。结果显示，BALF 隐球菌荚膜多糖抗原试验的敏感度明显高于BALF 免疫荧光染色，差异有统计学意义（χ2=19.40，P＜0.001）；两种检测方法特异性相同，差异无统计学意义（χ2=0.50，P＞0.05），见表4。

表4 免疫荧光染色和隐球菌荚膜多糖抗原检测诊断效能比较（%）

3 讨论

近年来，侵袭性真菌病的患病率及死亡率呈持续上升趋势，由于其起病隐匿、临床表现不典型，早期诊断困难[12,13]。目前侵袭性真菌病的确诊依靠组织病理学和（或）无菌标本的培养鉴定，但病理组织的获取往往需要侵入性操作，无菌标本的培养与鉴定所需时间长并且敏感性低，对疾病的尽早诊断、及时治疗带来了困难[7,12]。

真菌直接镜检操作简单，适用于多种临床样本，可快速报告结果，为侵袭性真菌病的尽快诊断提供临床依据[7]。目前临床常用真菌镜检方法包括免疫荧光染色、氢氧化钾湿片法、革兰染色、六铵银染色等。荧光染色是一种新近发展的镜检方法，可用于各种疑似真菌感染的检查，其染液中的增白剂能特异性的与真菌细胞壁中的β-多糖成分结合，并可吸收一定波长的紫外光，使真菌菌丝和孢子在荧光显微镜下呈现黄绿色或淡蓝色，与背景形成鲜明对比，容易辨认真菌形态，相较于传统的氢氧化钾湿片法和革兰染色，可避免因检测人员技术差异而造成的结果不一致，提高真菌检测的阳性率。既往荧光染色广泛用于浅表真菌感染的检测，近几年来有不少研究证明荧光染色亦可用于深部真菌感染的检测，相较于氢氧化钾湿片法有明显优势[14,15]。本研究对高度怀疑侵袭性肺部真菌感染患者的肺泡灌洗液进行免疫荧光染色、氢氧化钾湿片法、革兰染色，结果提示荧光染色的检出率与阳性率明显高于氢氧化钾湿片法及革兰染色。

血清学检查具有耗时短、高敏感型和特异性的优点，临床常用的血清学检查方法包括G 试验、GM试验、隐球菌荚膜多糖抗原检测等。（1，3）-β-D-葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞处理后（1，3）-β-D-葡聚糖可从细胞壁释放出来，从而使其在血液及其他体液中含量升高。本研究显示真菌荧光染色的灵敏性、阴性预测值、阳性预测值均高于G 试验，与既往报道相符[16]。需要指出的是，本研究中G 试验的灵敏性仅为14.7%，低于既往报道[17]，考虑原因如下：①在136 例同时进行BALF 免疫荧光和血清G试验的患者中，最终有68 位诊断为IPFI，其中肺隐球菌病36 例。既往观点认为隐球菌细胞壁外荚膜抑制（1，3）-β-D-葡聚糖的释放，故G 试验不适合用于隐球菌的检测，但近来有报道提示G 试验对隐球菌检测有应用价值。故本研究进行分析时并未将肺隐球菌病例排除在外。结合本研究结果，G 试验是否适用于隐球菌检测有待进一步研究。②造成G 试验假阴性因素较多，如患者存在巨噬细胞功能缺陷、标本保存不规范等。

GM 试验检测的是半乳甘露聚糖，其为广泛存在于曲霉菌和青霉菌细胞壁的一种多糖，菌丝生长时半乳甘露聚糖从菌丝顶端释放，是最早释放的抗原，故用于侵袭性曲霉病的早期诊断，具有较高的特异性。在本研究中66 位患者同时进行了BALF GM 试验与免疫荧光染色，以临床诊断为标准，免疫荧光的敏感度、特异性和阳性预测值均高于GM 试验。隐球菌荚膜多糖抗原通过检测隐球菌的荚膜荚膜多糖类物质对隐球菌进行检测，具有较高的敏感度与特异性，本研究结果显示其敏感度明显高于免疫荧光染色。

综上所述，相较于氢氧化钾湿片法以及革兰染色，真菌菌丝以及孢子经荧光染色后，轮廓清楚，易于识别，提高了真菌的检出率及阳性率。此外荧光染色能清楚辨别部分真菌的形态，如毛霉、曲霉、接合菌等，可在早期提供形态学诊断，弥补了真菌培养时间长的缺点。相较于常用的血清学检测方法，免疫荧光染色亦有相当高的诊断效能。但免疫荧光染色无法排除定值真菌，所以仍需要结合其他检测方法协助侵袭性真菌病的诊断。