基于网络药理学探讨七味白术散治疗脾虚泄泻的潜在机制

张慧婷 杨文波 沈丹平 马 聪

腹泻是我国婴幼儿最常见的疾病之一，临床多表现为大便次数增多和大便性状改变，按照病程长短可分为急性腹泻、迁延性腹泻和慢性腹泻[1-3]。该病归属于中医学泄泻范畴，其中脾胃虚弱是泄泻发生的重要病因病机，临床常以病程较长、大便稀溏为辨证要点[4]，代表方为七味白术散[5]。本研究运用网络药理学方法，构建七味白术散成分-靶点及网络，分析其治疗脾虚泄泻的潜在机制，为实验验证其具体机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 七味白术散药物成分及靶点筛选 利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://tcmspw.com/index.php）、中医药综合数据库（TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/）查找七味白术散各药物组成的具体成分，对所搜集到的化学成分进行整合，以口服生物利用度（OB）≥30%[6]，类药性（DL）≥0.18[7]为标准进行筛选，整理出具有活性成分的中药化合物。随后在上两种数据库中对各成分的潜在靶点进行查找。

1.2 脾虚泄泻相关靶点构建 在人类基因组数据库（GeneCards，https://www.genecards.org/）、人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https://omim.org/）中，以“Diarrhea”为关键词进行检索，查找脾虚泄泻相关靶点信息，构建七味白术散-脾虚泄泻-潜在靶点网络图。

1.3 七味白术散潜在靶点预测及成分-靶点网络构建 取七味白术散各药物的潜在靶点和脾虚泄泻相关靶点相交集的部分，作为七味白术散治疗脾虚泄泻的活性化合物和潜在治疗靶点，再利用网络图编辑软件（Cytoscape）进一步构建七味白术散药物-脾虚泄泻-靶点网络图。

1.4 蛋白质互作分析网络构建 利用临近基因重复实例的搜索工具（STRING，https://string-db.org/）对七味白术散治疗脾虚泄泻潜在靶点进蛋白质互作分析，为了获得更高的准确性，选取了最高置信度0.9进行评分。利用Cytoscape 找出相关度较高的基因，并构建靶点网络图。

1.5 七味白术散-脾虚泄泻-靶点图构建 在得到七味白术散与脾虚泄泻的共同靶点后，我们筛选出七味白术散治疗脾虚泄泻的有效活性成分，并使用Cytoscape 构建了七味白术散-脾虚泄泻-关键基因靶点网络图。

1.6 关键靶点功能注释 利用基因注释与分析数据库（Metascape，https://metascape.org/）对潜在治疗靶点进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集及基因本体论（GO）功能分析，并使用微生信数据库（Bioinformatics，http://www.bioinformatics.com.cn/）对主要KEGG 通路和GO 功能进行可视化分析。

2 结果

2.1 七味白术散活性成分筛选结果 从TCMSP、TCMID 中检索七味白术散各组成的化学成分，其中人参190 种，茯苓34 种，白术55 种，甘草280 种，藿香94 种，木香106 种，葛根18 种，共检索出化合物777 种。以OB≥30%，DL≥0.18 为标准进行筛选，并去除重复成分后共计157 种，其中人参22 种，茯苓15 种，白术7 种，甘草92 种，藿香11 种，木香6 种，葛根4 种。

2.2 七味白术散药物潜在靶点和脾虚泄泻疾病靶点网络构建 通过TCMSP 数据库筛选药物各活性组分的治疗靶点。我们共获得了七味白术散66 个治疗脾虚泄泻的有效活性成分，通过蛋白质数据库（Uniprot）对筛选出来的靶点进行分析和注释，转换成基因名并删除重复值后，获得潜在治疗靶点共261个。在GeneCards 数据库中以关键词“Diarrhea”检索疾病靶点，以相关性得分（Relevance score）≥10 为标准进行筛选，同时在OMIM 数据库中进行检索，两组数据合并，去除重复值后共获得疾病靶点348 个。将七味白术散靶点与脾虚泄泻靶点合并做图，最终构建出七味白术散-脾虚泄泻-潜在靶点网络图，见图1。

图1 七味白术散-脾虚泄泻-潜在靶点网络图

2.3 七味白术散治疗脾虚泄泻靶点构建 运用Bioinformatics 数据库绘制维恩图（见图2），得出七味白术散潜在作用靶点与脾虚泄泻疾病靶点的共同靶点共47 个，这47 个共同靶点可能是七味白术散治疗脾虚泄泻的潜在靶点。经过进一步筛选，最终构建出七味白术散-脾虚泄泻的靶点图，见图3。

图2 七味白术散治疗脾虚泄泻潜在共同靶点维恩图

图3 七味白术散-脾虚泄泻-靶点网络图

2.4 蛋白互作网络分析结果 将七味白术散与脾虚泄泻映射到的47 个潜在靶点进行分析，利用String数据库进行蛋白互作网络分析，得到蛋白互作网络图（见图4）。其中节点表示靶点蛋白，边表示蛋白之间相互关系。使用Cytoscape3.7.2 软件cytoHubba 插件，然后以相关度（Degree）≥两倍的中位数，并且相似度（Closeness）和中间性（Betweenness）＞中位数为标准对关键基因进行分析和筛选，获得了12 个关键基因。绘制这12 个核心靶点网络如下（见图5）。这12 个靶点主要涉及到凋亡、趋化、炎症、细胞周期、增殖等方面，并且可能为七味白术散治疗脾虚泄泻的核心靶点。

图4 七味白术散治疗脾虚泄泻治疗靶点蛋白互作网络图

图5 七味白术散治疗脾虚泄泻核心靶点互作关系图

2.5 七味白术散治疗脾虚泄泻核心靶点构建 在得到12 个核心靶点之后，进一步筛选七味白术散各药物中的活性成分，可以得出共有8 个活性成分映射到这12 个核心靶点上面。通过整理可以构建出七味白术散-脾虚泄泻-核心靶点网络图，见图6。

图6 七味白术散-脾虚泄泻-核心靶点网络图

2.6 KEGG 分析及GO 分析结果 使用Metascape将47 个潜在靶点进行KEGG 通路分析及GO 功能富集分析，KEGG 分子中有14 条显著意义的通路，利用Bioinformatics 绘制成气泡图可以看出，Pathways in cancer 是富集数目最多、最显著的通路（见图7）。GO 分析分别从分子功能、生物进程、细胞组分三个方面进行。以P＜0.01、最小计数为3、富集因子＞1.5 为标准进行筛选并做图（见图8）。在分子功能方面，一共富集到17 条显著条目，排名靠前的主要有细胞因子受体结合、脂质结合、蛋白激酶结合等；在生物进程方面富集到20 条显著条目，显著性较大的主要有对有细胞增殖的负调控、对有毒物质的反应、对伤害的反应等；在细胞组分方面富集到10 条显著条目，主要有膜筏、细胞质核周区等。

图7 七味白术散治疗脾虚泄泻靶点KEGG 图

图8 七味白术散治疗脾虚泄泻GO 富集BP、CC、MF 三合一图

3 讨论

根据蛋白互作分析图可以看出，七味白术散治疗脾虚泄泻的潜在靶点有47 个，进一步筛选出的核心靶点有12 个。信号转导和转录激活因子3（STAT3）能够调节人体免疫，过度激活或失活均会使人体产生疾病[8]，同时STAT3 在自噬、炎症反应等方面也有作用[9]。白介素1β（IL-1β）是炎症反应的关键介质，对宿主反应和病原体的抵抗起到了至关重要的作用[10]，在炎症发生时，IL-1β 会通过白介素6（IL-6）介导铁调素的表达来参与炎症反应[11]。白介素4（IL-4）在人体中有免疫调节和抗炎的作用，目前对IL-4 靶点的研究主要用于治疗变应性疾病方面[12]。研究表明，IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、趋化因子8（CXCL8）与腹泻的关系非常密切。腹泻发生时，患者体内炎症因子IL-6 会大量释放[13]，在诊断腹泻时，血液中IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）的水平亦可提供依据[14]。动物实验表明，腹泻减轻时，小鼠体内IL-6 水平会降低，IL-2、IL-4 水平会升高[15]，腹泻在有效治疗后，IL-1β 和TNF 的水平会明显降低[16]，CXCL8 的释放会导致肠上皮屏障功能的丧失而发生腹泻[17]。

研究表明，表皮生长因子（EGF）和表皮生长因子受体（EGFR）能够保护胃肠道黏膜，释放营养，促进胃肠道黏膜修复[18]。相反，EGF 的受体抑制剂也是引起腹泻的重要原因[19]。内整流K+通道（AKT1）和肿瘤蛋白P53（TP53）是研究较多的癌基因，在大多数癌症中均有表达[20-21]，目前尚未检索到两者与腹泻的直接关系，但在癌症患者的腹泻治疗中仍起着作用[22]。综上所述，这些核心靶点主要在抗炎、细胞增殖、凋亡、自噬和细胞周期等方面起作用，并与脾虚泄泻存在密切的相关性。

在KEGG 通路富集分析中，Pathways in cancer是七味白术散治疗脾虚泄泻的潜在核心通路。Pathways in cancer 是癌症治疗中重要的信号通路[23]，包括了血管内皮生长因子（VEGF）、TP53、信号转导转录激活蛋白（Jak-STAT）等信号通路，本研究所富集到 的 核 心 靶 点IL-6、STAT1、STAT3、EGF、VEGF、TP53 等均包含于其中，因此Pathways in cancer 成为富集分数最高的通路。

在GO 功能分析中，细胞因子活性是富集到的主要细胞功能活动，而细胞因子与炎症性疾病的发生有着密切的关系[24]。在蛋白互作分析中，分析到的核心靶点如TNF、STAT3、IL4、IL-6 等均与炎症反应相关。细胞增殖的负调控是GO 功能富集到的主要生物进程，研究表明大肠杆菌在胃肠道感染中能够抑制肠细胞的增殖，VEGF 对增殖的负调控是动物胃肠炎的发生机制之一[24]，目前暂未发现有文献提出这些生物进程在脾虚泄泻方面具有作用，但为实验研究这些功能在脾虚泄泻方面的作用提供了思路。膜筏是GO 富集到的主要细胞组分之一，研究表明，在结肠炎和细菌相关性腹泻中，膜筏对于细菌的粘附和信号传导起重要的作用[25]。

本研究通过网络药理学研究方法，对七味白术散的成分、药物作用靶点和治疗脾虚泄泻的潜在靶点及作用机制进行了研究和总结，发现七味白术散治疗脾虚泄泻的潜在机制可能是STAT3、TNF、IL6、AKT1、EGFR、CXCL8、IL1B、TP53、STAT1、IL4、EGF、IL2 等核心靶点通过Pathways in cancer 等通路，发挥了细胞因子受体结合、脂质结合、蛋白激酶活性结合的作用。

4 不足与展望

本研究通过生物信息学方法初步探索了七味白术散的主要成分和治疗作用，为下一步实验论证七味白术散治疗脾虚泄泻提供了研究基础和研究思路。一般认为中药复方通过多靶点、多途径参与疾病的治疗，本文通过网络药理学也初步论证了这一说法，但仍有许多不足之处。

从研究可以看出，核心靶点对应的成分主要存在于人参、葛根、藿香、甘草4 味中药中，而在茯苓、木香、白术中并未发现。这可能有以下几种原因：（1）数据库的数据并不完善。本研究中的数据均来源于在线数据库，数据库的完善与否对研究结果的完整性起着至关重要的作用。（2）未体现出方剂学君臣佐使思想。在七味白术散中，人参为君，白术为臣，茯苓、葛根、藿香、木香为佐，甘草为使。在成分和靶点筛选后，人参和甘草成分出现频率最高，且每味药的权重相同，并不能看出君药人参和使药甘草在权重上的区别。（3）网络药理学的筛选为中药机制的挖掘提供了一个良好的思路，但仍需要实验进一步验证，这也是本研究的不足之处。