一种简便分离假禾谷镰刀菌的选择性培养基

徐建强，范蓉思媛，王 硕，罗诗瑶，韩 易，李建锋，刘圣明

(1.河南科技大学 园艺与植物保护学院，河南 洛阳 471023；2.洛阳市农业技术推广服务中心，河南 洛阳 471003)

0 引言

近十几年，黄淮海地区广泛推广小麦-玉米秸秆还田技术。秸秆还田能提高小麦生育后期土壤酶活性，促进秸秆分解，提高土壤养分含量[1]，并能提高土壤蓄水保墒能力，促进小麦根系生长发育，提高产量[2]。但发病秸秆滞留在田间，导致病原菌菌量逐年累积，小麦土传病害发生愈加严重[3]。主要由禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)引起的小麦纹枯病，现已在河南各麦区普遍发生，且田间已出现了对防治药剂敏感性下降的菌株[4]。主要由假禾谷镰刀菌(Fusariumpseudograminearum)侵染所致的小麦茎基腐病是中国黄淮海地区小麦生产中近几年出现的一种新的土传病害[5]。该病害从分蘖至成熟期均可为害，发病后会导致小麦茎基部近地面1～2段茎秆变褐腐烂，影响植株水分和无机盐运输，使其地上部分矮缩，严重时导致小麦枯白穗，影响小麦产量[6]。病菌产生的毒素尽管无法运输到麦粒，但由小麦秸秆制成的动物饲料，却仍存在潜在威胁[7]。小麦茎基腐病已被河北省和陕西省列为二类农作物病虫害[8-9]，而小麦纹枯病及小麦茎基腐病则同时被河南省和山东省列为二类农作物病虫害[10-11]。

对假禾谷镰刀菌的分离、培养是进行小麦茎基腐病研究的第一步。作为一种新病害，目前国内外对假禾谷镰刀菌的分离大多采用传统的组织分离法[12-13]。组织分离法广泛应用于植物病原菌分离，在样品较少时容易操作，但分离大量病原菌群体时组织分离法的诸多弊端便会显现。鉴于此，多位研究者开发了分离病原菌的选择性培养基，如分离棉花枯萎病菌[14]、黄萎病菌[15]、牡丹黄斑病菌[16]和小麦纹枯病菌[17]。本文以马铃薯蔗糖琼脂(potato sucrose agar，PSA)培养基为基础培养基，研究了硫酸链霉素、乙膦铝、代森锰锌和多菌灵对假禾谷镰刀菌和常见的污染菌——青霉、曲霉和链格孢菌菌丝生长的影响，优化了4种物质使用时的质量浓度，制备了一种可快速、大量分离假禾谷镰刀菌的选择性培养基。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：小麦茎基腐病菌株SQYC-2，河南科技大学菌物资源及病害防控实验室(以下简称实验室)保存，2021年采用组织分离法自河南省商丘市虞城县的小麦病株上分离，特异性引物扩增后鉴定为假禾谷镰刀菌(F.pseudograminearum)；青霉菌株SQYCP-1，实验室保存，分离假禾谷镰刀菌时的污染菌，纯化后鉴定为扩展青霉(Penicilliumexpansum)；曲霉SQYCAs-1，实验室保存，分离假禾谷镰刀菌时的污染菌，纯化后鉴定为焦曲霉(Aspergillusustus)；链格孢SQYCAl-1，实验室保存，分离假禾谷镰刀菌时的污染菌，纯化后鉴定为小麦生链格孢(Alternariatriticicola)。

供试药剂。72%硫酸链霉素可溶性粉剂(soluble powder，SP)：河北三农农用化工有限公司；70%代森锰锌可湿性粉剂(wettable powder，WP)，陕西上格之路生物科学有限公司；80%乙膦铝可湿性粉剂，美国世科姆公司。制剂均预溶于灭菌双蒸水中，其中硫酸链霉素配成105μg/mL母液，代森锰锌和乙膦铝配成104μg/mL母液。98%多菌灵原药：山东省双星农药厂，预溶于0.1 mol/L稀盐酸中，配成104μg/mL母液。所有母液均放入4℃冰箱中保存。

1.2 试验方法

1.2.1 4种药剂对假禾谷镰刀菌及污染真菌菌丝生长的影响

采用菌丝生长速率法[18]。选取供试的4种药剂，以PSA为基础培养基，各设置6个质量浓度(表1)，于平板中央分别接入直径5 mm的供试菌株的新鲜菌饼，每处理重复3次，以不含药剂的PSA平板上接种的菌饼为对照。25℃下培养3～5 d后采用十字交叉法测量菌落直径(mm)，按下式计算各质量浓度处理时药剂对菌丝生长的抑制率(%)。

菌丝生长抑制率(%)=[(对照菌落直径平均值-处理菌落直径平均值)/(对照菌落平均值-菌饼直径)]×100%。

1.2.2 供试药剂的正交设计

利用正交设计筛选4种抑菌物质不同浓度的配比效果。结合1.2.1中确定的每种抑菌物质在选择性培养基中的使用质量浓度，选择各药剂中对假禾谷镰刀菌抑制作用较弱、而对3种污染菌抑制作用较强的质量浓度；在SPSS 20.0软件中进行4因素3水平共9个处理L9(34)的正交设计，按照各处理中各抑菌物质的质量浓度，制备含药培养基，将4种供试菌株分别接入含药培养基中，方法同1.2.1。

1.2.3 选择性培养基在假禾谷镰刀菌分离中的应用

2022年5月，携带室内配制好的假禾谷镰刀菌选择性培养基，至河南省洛阳市伊川县彭婆镇杨营村和新安县五头镇五头村的小麦试验田。在这2块试验田中，小麦茎基腐病发生普遍。从2块田中各选取症状典型(茎秆第1，第2茎节变褐)的病株60株。30株直接在田间地头采用选择性培养基法分离：剪取发病茎节交界处，直接放入选择性培养基上；另外30株带回实验室，采用组织分离法分离。比较2种分离方法的异同。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2010软件计算各处理平均菌落直径及抑菌率。利用DPS V6.55软件中的最小显著差异(least significant difference，LSD)法进行药剂不同质量浓度间的差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同药剂对假禾谷镰刀菌及3种污染菌菌丝生长的影响

表1为4种杀菌剂对假禾谷镰刀菌及3种污染菌菌落直径的抑制作用。表2为4种杀菌剂对假禾谷镰刀菌及3种污染菌菌落直径的平均抑制率。由表1及表2可知：硫酸链霉素低质量浓度(5～25 μg/mL)时对假禾谷镰刀菌有较强的抑制作用，但高质量浓度(50～100 μg/mL)时抑制作用却减弱，这可能是由于假禾谷镰刀菌对硫酸链霉素的耐药性机制。对青霉生长有一定的促进作用，对曲霉的抑制表现为同假禾谷镰刀菌一样的效果，而高质量浓度(50～100 μg/mL)对链格孢的生长有较强的抑制作用。

表1 4种杀菌剂对假禾谷镰刀菌及3种污染菌菌落直径的抑制作用

表2 4种杀菌剂对假禾谷镰刀菌及3种污染菌菌落直径的平均抑制率

随着乙膦铝质量浓度增加，对真菌的抑制作用有增强的趋势，对假禾谷镰刀菌也有一定的抑制作用。在250 μg/mL质量浓度内，对假禾谷镰刀菌的抑制率在30%以下。对青霉的抑制作用较强，而对曲霉和链格孢的抑制作用稍弱。

低质量浓度多菌灵(0.062 5～0.25 μg/mL)对假禾谷镰刀菌的抑制作用较弱，最高仅为13.470%，但质量浓度为0.5 μg/mL时，对假禾谷镰刀菌的抑制作用增强，达到47.460%。低质量浓度多菌灵对青霉、曲霉有强烈的抑制作用，0.5 μg/mL时抑制作用即可达到100%。对链格孢的抑制效果随质量浓度增加而增强，低质量浓度时的抑制率在50%左右。

在质量浓度为3.125～25 μg/mL时，代森锰锌对假禾谷镰刀菌的抑制作用均较弱，而50 μg/mL时，抑制作用增强。低质量浓度对青霉的抑制作用较弱，25 μg/mL以上时抑制作用增强。对曲霉的抑制作用较弱，12.5 μg/mL以上甚至有促进作用。对链格孢的抑制作用随着质量浓度增加而增强。

由上述分析可知，选择性培养基中硫酸链霉素、乙膦铝、多菌灵和代森锰锌的适宜质量浓度分别为50～100 μg/mL、150～250 μg/mL、0.062 5～0.25 μg/mL及6.25～25 μg/mL。但综合考虑4种药剂对假禾谷镰刀菌及3种污染菌的抑制率，可以看出单独添加上述药剂后，如果用于筛选分离假禾谷镰刀菌效果均不理想，需进行4种药剂的正交设计试验，以确定选择性培养基中抑菌物质的合适质量浓度。

2.2 4种抑菌物的正交设计

利用SPSS 20.0软件进行4因素3水平的正交设计，及对假禾谷镰刀菌菌落直径的抑制作用如表3所示。由表3中可以看出，共9个处理L9(34)。4种抑菌物质不同质量浓度配比，对假禾谷镰刀菌会产生不同的抑制率，平均抑制率从26.660%到56.760%；尽管在T4、T6和T8这3种处理下，平均抑制率均超过50%，但此时的菌落直径仍达到34.333～35.500 mm，且假禾谷镰刀菌生长速率较快，可以通过将选择性培养基上长出的假禾谷镰刀菌尽快转接到PSA培养基上，获得纯培养。9个处理对青霉、曲霉和链格孢均有很好的抑制作用，平均抑制率均达到90%以上，大部分都达到了100%。故选择性培养基中硫酸链霉素、乙膦铝、多菌灵和代森锰锌的使用质量浓度分别为50～100 μg/mL、150～250 μg/mL、0.062 5～0.25 μg/mL和6.25～25 μg/mL，最适宜浓度分别为75 μg/mL、200 μg/mL、0.25 μg/mL和6.25 μg/mL。

表3 4种杀菌剂的正交设计及对假禾谷镰刀菌菌落直径的抑制作用

2.3 选择性培养基的应用

表4为组织分离法和选择性培养基法的差异。采用组织分离法分离时，需经过茎秆分段再切块、多次消毒、清水冲洗及滤纸吸干等步骤，1个病样分离约需10～15 min，病株多时相当费力。且2次消毒及3次清洗时需要的培养皿较多(多于100副)，培养时每个病株又需要1个培养皿，所需耗材很多。操作过程中如乙醇及次氯酸钠(NaClO)消毒时间把握不准，易将病菌也杀死，故对操作要求高。50个病株分离了4 d才完成，共分离到小麦茎基腐病菌45株，分离频率为90%。

表4 组织分离法和选择性培养基法的差异

采用选择性培养基法分离时，剪取第1、第2茎节变褐的茎段，约0.5 cm，直接放入选择性培养基中，25 ℃培养3～5 d，待病变组织长出菌丝后，将菌丝转入新鲜的PSA培养基上，培养出纯菌落后转接保存。选择性培养基的制备是此法的关键，制备好后0.5 d即可完成50株病菌的分离，3～5 d即可获得茎基腐病菌的纯培养物，操作时间大大缩短，操作步骤大大简化。经过5 d，50株小麦茎基腐病病株全部分离完毕，共得到小麦茎基腐病菌47株，分离频率为94%。

图1为PSA培养基及选择性培养基自发病茎段上分离小麦茎基腐病菌的效果比较。图1a为组织分离法操作时平板上长出的菌落，有部分茎秆未长出，且有的茎秆长出的菌落较小。图1b为选择性培养基法操作时平板上长出的菌落，每个茎秆都长出，且菌落较大。2种分离方法获得的菌落的形态相似：气生菌丝茂盛，有色素的分泌，都是镰刀菌菌落的典型特征。对2种分离方法获得的92株病菌进行菌落形态特征观察，结果表明：92株全部为镰刀菌。

(a) 组织分离法PSA培养基上长出的菌落 (b) 选择性培养基上长出的菌落

3 讨论

本文采用向PSA培养基中添加抑菌物质的方法，基于假禾谷镰刀菌和3种常见污染菌对药剂敏感性的差异，获得了一种自发病小麦茎秆上简便分离假禾谷镰刀菌的选择性培养基，即在PSA培养基基础上，添加50～100 μg/mL的硫酸链霉素、150～250 μg/mL的乙膦铝、6.25～25 μg/mL的代森锰锌及0.062 5～0.25 μg/mL的多菌灵，可以达到选择性分离假禾谷镰刀菌的目的。采用选择性培养基法，不仅可以提高分离成功率，而且可以在自然条件下进行，具有省时、省力的特点，适合大量病株的分离。

本文中硫酸链霉素所用质量浓度同文献[14]报道的选择性培养基中硫酸链霉素的质量浓度相同，不仅可抑制分离时细菌的滋生，而且对链格孢也表现出较强的抑制作用。对于分离时的青霉、曲霉等污染菌，文献[14]和文献[19]采用培养基中加入敌克松(敌磺钠)的方法，但敌克松易光解，不适宜将选择性培养基带到大田里使用，且有病组织的培养基在放置时也需避光培养。本文研究结果表明：在较高质量浓度时，多菌灵对假禾谷镰刀菌和3种污染菌都有很强的抑制作用，质量浓度降低，对假禾谷镰刀菌的抑制作用减弱，但达不到对3种污染菌的抑制作用。为此，本文加入了代森锰锌，在两者同时添加的情况下，可以达到对3种污染菌很好的抑制作用。文献[20]在分离荔枝霜疫霉时则是将多菌灵和咪鲜胺、异菌脲同时添加，达到对污染菌的抑制作用。

基础培养基的成分及抑菌物质的选择和适宜浓度是选择性培养基制备的关键。本文中4种抑菌物质也可以用来制备分离牡丹黄斑病菌的选择性培养基，但由于病菌对药剂的敏感性不同，4种物质的配比及适宜浓度有所差异[16]。另外，以水琼脂培养基为基础培养基，向其中加入100 μg/mL的硫酸链霉素、1 μg/mL的多菌灵和50 μg/mL的多果定，还可以选择性地分离禾谷丝核菌[17]。

在分离假禾谷镰刀菌时，偶尔还会受到根霉菌的污染。本文在筛选抑菌物质时，曾参照文献[20]在筛选荔枝霜疫霉选择性培养基时抑制毛霉菌的方法，使用200 μg/mL的异菌脲，但对根霉的抑制作用并不理想，有必要继续筛选对根霉有选择性抑制作用的杀菌剂。在实际操作中，由于假禾谷镰刀菌生长速率快，在根霉布满整个培养皿前可及时转接来避免根霉的影响，故根霉对假禾谷镰刀菌的分离和纯化影响较小。

小麦茎基腐病是由多种病菌引起，除了假禾谷镰刀菌外，禾谷镰刀菌(F.graminearum)、三线镰刀菌(F.tricinctum)、木贼镰刀菌(F.equiseti)等也可侵染致病，但分离频率较低[12,21]。本文的选择性培养基，在分离引起茎基腐病的其他镰刀菌上是否可用，尚需进一步的验证。而对于假禾谷镰刀菌为优势种群的河南、河北及山东等地，则在生产中可以推广、使用本文开发的小麦茎基腐病菌选择性培养基。