HPLC法同时测定辣椒粉中5种红色合成着色剂

曹永梅，吴薇

上海旺旺食品集团有限公司（上海 201103）

辣椒粉是一种常用的辛香调味料，为牟取利益、降低成本，辣椒粉的掺假掺杂时有报道[1-2]*，欧盟调查报告列出10大易掺假食品名单中辣椒粉就被列入其中[3]*。有的不法商家为使辣椒粉有一个好的卖相，非法添加非食用色素或超范围使用人工合成着色剂[4-6]*，“涉红”的辣椒粉屡禁不止。非法添加非食用红色素主要指苏丹红、罗丹明B、酸性橙II等，针对这类色素的检测方法研究较多[7-12]*。

GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》对食品中允许使用的合成着色剂种类、使用范围和限量进行详细规定，未在该标准使用范围内使用此类合成着色剂就属于超范围使用。GB 5009.35—2016《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》中，方法的适用范围不含辣椒粉。辣椒粉因基质复杂，使用国标方法中的前处理条件目标物回收率低，提取不完全[13]*，针对辣椒粉中人工合成着色剂的检测方法相关文献也较少。试验采用高效液相色谱法（二极管阵列检测器），测定辣椒粉中的新红、苋菜红、胭脂红、诱惑红、赤藓红B这5种红色合成着色剂，对测定条件进行优化，灵敏度高，准确性好，是一种简便、快速、准确的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备

安捷伦1260高效液相色谱、二极管阵列检测器（安捷伦）；XS205分析天平（美国梅特列-托利多）；ELGA Classic UV超纯水机（英国ELGA）；Sigma2-16P离心机（西格玛）；漩涡混合仪XH-D（上海皓庄）；超声波清洗仪SCQ（上海安谱）；旋转蒸发仪Laborota 4000（海道夫）；氮吹仪DC12H（上海安谱）。

1.1.2 试剂与标准品

标准品：新红（CAS 220658-76-4，上海安谱），苋菜红（CAS 915-67-3，上海安谱），胭脂红（CAS 1390-65-4，百灵威），诱惑红（CAS 25956-17-6，上海安谱），赤藓红B（CAS 16423-68-0，百灵威）。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸铵（均为色谱纯，Merck）；乙醇、氨水、正己烷（均为分析纯，国药集团）。

提取剂采用氨水-70%乙醇水溶液1∶99（V/V），混匀。

SPE小柱ProElut PLS 500 mg/6 mL（Dikma，cat.#68005）。

试验用水均为经超纯水机处理后的水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

样品提取：称取0.1 g（精确至0.000 1 g）辣椒粉于50 mL离心管中，加入30 mL正己烷，涡旋1 min，超声15 min，以6 000 r/min离心5 min，弃去上清液；加入20 mL提取剂，涡旋5 min，超声10 min，以6 000 r/min离心5 min，立即取上清液于100 mL旋转蒸发瓶中。下层残渣继续用15 mL提取剂重复提取2次，合并3次上清液。

待净化液：旋转蒸发瓶中收集的液体，于50 ℃真空浓缩至约6 mL，加入80 μL甲酸酸化，混匀后得到待净化液。

样品净化：分别用5 mL甲醇、5 mL水将SPE小柱进行活化、平衡，加入待净化液，用少量乙醇淋洗旋转蒸发瓶并全部转移到小柱上，弃去流出液，加入5 mL水洗脱，弃去流出液，将SPE柱抽干，加入6 mL 2%氨水甲醇溶液，收集洗脱液，将洗脱液在45 ℃下氮气吹至约0.5 mL，用水定容至2 mL，0.45 μm滤膜过滤后，待上机。

累计预扣预缴应纳税所得额=累计收入-累计免税收入-累计减除费用-累计专项扣除-累计专项附加扣除-累计依法确定的其他扣除

1.2.2 标准使用液的配制

单标标准储备溶液（1 000 μg/mL）：称取适量（精确至0.1 mg）各标准品于50 mL棕色容量瓶中，分别用10%甲醇溶解后定容，混匀，置于-4 ℃下密封保存。

混合标准中间溶液（10 μg/mL）：依次吸取0.5 mL单标标准储备液于50 mL棕色容量瓶中，用超纯水稀释后定容。

1.2.3 标准曲线制作

依次从1.2.2混合标准中间溶液（10 μg/mL）中吸取0.1，0.5，1.0，2.0和5.0 mL分别于10 mL容量瓶中，用超纯水稀释定容，制作成0.1，0.5，1.0，2.0和5.0 μg/mL的标准曲线工作溶液，过膜，待测。

辣椒粉HPLC色谱图（5种目标物混标图谱及辣椒粉样品加标图谱）详见图1。

图1 辣椒粉HPLC色谱图

色谱柱Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温35 ℃；进样体积20 μL；流速1.0 mL/min；检测波长509 nm。流动相配比及梯度洗脱时间见表1。

表1 流动相配比及梯度洗脱时间

2 结果与讨论

2.1 试验条件的选择

2.1.1 检测波长的选择

在二极管阵列检测器全波长范围内进行光谱扫描，各物质在表2所示波长具有明显吸收，因此探讨在254，509和520 nm这3个波长的谱图后发现，254 nm处除了目标物还有很多细小的杂峰，509 nm下的谱图目标物响应最大，且无基质干扰，故试验选择509 nm作为检测波长。

表2 各目标物的光谱扫描波长 单位：nm

2.1.2 提取溶剂的选择

试验中5种合成着色剂均为水溶性色素，能溶于水和乙醇，选用水、乙醇、氨水-70%乙醇水溶液作为提取试剂进行测试，氨水-70%乙醇水溶液溶解度最大，并且用氨水-乙醇溶液可大幅减少氮吹时间。综合考量，选取氨水-70%乙醇水溶液为此次试验提取溶剂。

2.1.3 前处理优化

样品经提取剂提取3次后直接真空浓缩，试验中会产生大量泡沫，且在过SPE柱时导致柱堵塞。增加正己烷除脂步骤后，不仅降低油脂对小柱净化的影响，同时能很好地消除杂质的干扰。

2.2 线性范围

分别取混合标准使用液，用HPLC分别测其峰面积，5种目标化合物在0.1～5 μg/mL质量浓度范围内，其浓度和峰面积呈线性关系，相关系数在0.999以上。保留时间、峰面积、线性方程及相关系数详见表3。

表3 混标之峰面积及相关系数

2.3 回收率及精密度试验

称取样品，在2个添加水平下加标，按1.2.1步骤处理，加标回收率及精密度见表4。在2个添加水平下目标物样品平均加标回收率分别在81.23%～88.92%和87.82%～96.24%之间，SRSD＜7.76%，能满足定量检测的要求，详见表4。

表4 样品回收率及精密度（n=6）

2.4 检出限和定量限

吸取加标样品（添加0.5 μg）重复进样10次，以3倍信噪比及10倍信噪比计算，得出检出限及定量限，详见表5。

表5 各目标物的检出限和定量限 单位：mg/kg

3 结论

试验使用高效液相色谱分离系统，梯度洗脱进行辣椒粉中5种红色合成着色剂的测定，前处理采用正己烷脱脂后提取，过SPE小柱，可很好地消除杂质的干扰，有效提取目标物，峰形尖锐，分离效果良好。试验方法可用于定性筛查辣椒粉中超范围使用红色合成色素，同时也可实现准确定量。试验结果可为企业和监管部门提供科学依据及技术支撑，从而更好保证辣椒粉的质量安全，维护广大企业及消费者的利益。