不同支气管镜采样方式联合二代测序在重症肺炎并机械通气患者病原诊断中的应用

李耀军，李琳

（河南省漯河市中心医院 呼吸与危重症科，河南 漯河 462000）

重症肺炎已成为全球关注的公共卫生问题，肺部感染病原学的诊断和敏感药物的选择是重症肺炎患者治疗的关键问题。目前常用的微生物学检测方法如涂片、病原微生物的培养及聚合酶链反应已不能满足临床需求［1］。近年来，基因组分析二代测序技术（mNGS）不断成熟及普及，为病原学诊断提供了一种新的有力手段，mNGS效能较传统病原微生物检测技术更强大［2］，但也有一定的局限性，还需要进行更多的临床探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2020年1月至2021年6月我院RICU收治的40例重症肺炎并机械通气患者，其中男性23例，女性17例；年龄21～83岁，平均年龄（49.23±9.31）岁。

1.2 方法

1.2.1 取样及传统病原学检测 由同一医护团队对入组患者进行样本取样，取样方式包括保护性毛刷（PSB）取样、常规支气管肺泡灌洗（BALF）取样、支气管镜吸取（ETA）取样。取样结束后均进行常规细菌、真菌、抗酸涂片及培养。痰定量培养的细菌浓度≥107cfu／mL，经BALF培养的细菌浓度≥104cfu／mL，经ETA细菌培养的浓度≥105cfu／mL，经PSB所取样本后培养的细菌浓度≥103cfu／mL时为致病菌的可能性较大。

1.2.2 mNGS检测 ①DNA提取：取0.5～3 mL痰液，混合震荡后依据试剂盒步骤提取DNA。②文库构建和测序：质控文库片段大小，质控分析DNA文库的浓度，环化后形成单链的环形结构。文库环化后再通过滚环复制后生成DNA纳米球（DNB），将其加载到测序芯片，通过illumina Hiseq2500／MiSeq测序。③数据分析：通过比对，将高质量数据中比对上人参考基因序列部分去除，再去除剩下数据中的低复杂度部分，然后再与专用微生物大数据进行比对，最后将比对后数据按照细菌、病毒、真菌、寄生虫进行分类与排列。依据检出毒力基因、耐药基因的信息应用抗菌药物治疗。

1.3 观察指标参考《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南》［3］对病原体的诊断标准为金标准，计算不同取样方式病原体检测的阳性率、敏感度、特异度、准确率。诊断标准：在临床诊断基础上，若同时满足以下任一项即可作为致病菌确定的依据。①在合格的下呼吸道分泌物中上皮细胞与中性粒细胞数的比值小于2∶5（每个低倍视野中上皮细胞＜10个，中性粒细胞数＞25个），患者的临床表现典型且经PSB、BALF、肺组织或无菌体液培养后发现了病原菌。②在组织损害基础上加上在直接镜检、细胞病理学或肺组织标本的病理学检测中找到真菌。③病毒血清中的IgM抗体由阴转阳、肺不典型病原体或急性期和恢复期双份血清特异性IgG抗体滴度的变化≥4倍。计算公式：阳性率＝阳性例数／总例数×100%；敏感度＝真阳例数／（真阳例数＋假阴例数）×100%；特异度＝真阴例数／（真阴例数＋假阳例数）×100%；准确率＝真阳例数／（总例数－真阴例数）×100%。

1.4 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件处理数据。计数资料以n（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PSB＋mNGS检测病原体的诊断效能比较PSB＋mNGS检测病原体的阳性率、敏感度、特异度均高于PSB＋传统病原学检测 （P＜0.05）。见表1。

表1 PSB＋mNGS检测病原体的诊断效能比较

2.2 BALF＋mNGS检 测 病 原 体 的 诊 断 效 能 比 较BALF＋mNGS检测病原体的阳性率、敏感度、特异度均高于BALF＋传统病原学检测（P＜0.05）。见表2。

表2 BALF＋mNGS检测病原体的诊断效能比较

2.3 ETA＋mNGS检测病原体的诊断效能比较ETA＋mNGS检测病原体的阳性率、敏感度、特异度均高于ETA＋传统病原学检测 （P＜0.05）。见表3。

表3 ETA＋mNGS检测病原体的诊断效能比较

2.4 不同支气管镜采样方式联合mNGS对病原体的诊断效能比较PSB＋mNGS、BALF＋mNGS、ETA＋mNGS检测病原体的阳性率（100.00% vs.95.00% vs.100.00%）、敏感度（90.00%vs.95.00% vs.95.00%）、 特 异 度 （95.00% vs.85.00% vs.90.00%）及准确率（100.00% vs.100.00% vs.100.00%）比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

重症肺炎的病程发展迅速，可由局部感染迅速进展到全身感染，有时还会伴有严重的脓毒症［4］。近年来，随着mNGS技术不断成熟及普及，为病原学的诊断提供了一种新的诊断手段。与传统病原微生物检测技术相比，mNGS具有更强大的效能，但也存在一定的局限性。

本研究结果显示，PSB、BALF与ETA采样后mNGS检测的阳性率、敏感度及特异度均高于传统病原学检测（P＜0.05），提示mNGS对病原微生物的检测效能优于传统病原学检测，与Long等［5］的研究结果一致。分析其原因可能为：mNGS不仅能直接检测所提取标本中的全部核酸片段，在通过生物信息学分析法鉴定出标本中所含核酸种类的同时，还能获得病原体的序列数及覆盖度等定量分析的数据；另外，mNGS检测前所用的标本不需要进行培养，不仅可避免难以培养的病原体漏检，检测时还能直接非特异性地测定出全部核酸片段，无需提前选定检测范围，最大限度地从根源上避免了病原体的漏检。因此，与传统病原学检测相比，mNGS病原检测的特异度、阳性率及敏感度均明显提高。本研究结果还显示，PSB＋mNGS、BALF＋mNGS、ETA＋mNGS检测病原体的阳性率、敏感度、特异度 及准确 性比较 差异无 统计学 意义 （P＞0.05），表 明mNGS对病原微生物的检测效能不受采样方式的限制。

综上所述，与传统病原学检测相比，mNGS对病原体诊断效能更好，临床上应根据实际情况选择适当的采样方式进行mNGS检测，对重症肺炎患者的诊治具有重要的意义。