2021—2022年长春市水痘-带状疱疹病毒流行株基因序列的特征分析

夏立新，孙跃秋，王梦涵，姜雪鸥，周莹，顾建阳

长春祈健生物制品有限公司，吉林 长春 130000

水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）为双链DNA 病毒，基因组由124 884个碱基对组成，包含71个开放读码框（open reading frame，ORF），共编码 69种蛋白［1-2］。VZV不同毒株间的遗传变异主要表现为单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）。有研究根据ORF22上的6个SNPs对VZV进行基因分型，并按流行区域分别命名为European 1、European 2、Japanese、Mosaic 1和Mosaic 1［3-4］。通过全基因组测序及对大量数据分析，逐步完善了VZV的基因分析方法，并于2008 年世界VZV 共识命名会议上，根据27 个SNPs重新为5个分支命名，即Clade 1 ～ Clade 5［5］。

VZV 是一类传染性极强的病毒，首次感染人体可引发水痘，多发于儿童，感染后病毒长期潜伏于患者体内，当免疫力降低时再激活诱发带状疱疹［6-8］。有调查显示，VZV 感染是我国较严重的公共卫生问题之一，接种水痘减毒活疫苗可有效控制VZV 的传播［9-10］。膜抗原荧光抗体（fluorescent antibody to membrane antigen，FAMA）法为鉴定VZV 感染的金标准，其原理是以VZV 作为抗原，可与血清中的VZV 特异性抗体发生结合［11-12］。为了解2021—2022年长春市VZV 流行株的分子特征，本研究采用FAMA法鉴定VZV阳性患者血清，再提取确诊患者疱疹液样本DNA，PCR 法扩增多个ORF，通过比对SNPs 位点进行VZV基因分型；并采用限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphisms，RFLP）试验区分 VZV临床株及疫苗株。以期通过对VZV临床株的流行病学调查，为水痘和带状疱疹的预防提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 样本 59份血清及相应疱疹液样本源自2021—2022年吉林大学中日联谊医院收治的长春市水痘或带状疱疹患者，均于-70 ℃保存。

1.2 病毒及细胞 VZV疫苗株（Oka株）及2BS细胞均由长春祈健生物制品有限公司提供，均于-70 ℃保存。

1.3 主要试剂 A 型病毒DNA 提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；胰蛋白酶购自美国思拓凡公司；FITC 标记的羊抗人IgG 购自英国Abcom 公司；磁珠法 PCR 产物纯化试剂盒、2 × Phanta Flash Master Mix、PstⅠ、BglⅠ和 SmaⅠ酶均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.4 血清样本的鉴定 采用 FAMA 法［13-14］。用含10%新生牛血清的MEM 培养基于37 ℃培养2BS 细胞，取对数生长期的2BS 细胞，按MOI = 0.01 感染Oka 株。细胞病变达90%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，300 ×g离心 10 min，用 PBS 将沉淀稀释至2×105个／mL，加入12孔载物片，20 μL／孔，于（37 ± 0.5）℃孵育30 min；浸入丙酮中固定15 min；加入灭活血清样本（用PBS按1∶2～1∶16 384稀释），20 μL／孔，继续孵育30 min；加入FITC标记的羊抗人IgG（1∶2 000 稀释），20 μL／孔，继续孵育30 min；50%甘油封片，置荧光显微镜下观察。以呈黄绿色膜性荧光的最高稀释倍数为抗体效价，当血清抗体效价＞4时，判为阳性。

1.5 VZV的基因分型 根据NCBI GenBank数据库提供的VZV Dumas株序列（X04370.1），应用Primer 5.0软件设计分别包含ORF1、12、16、17、21、22、37和54的SNPs 位点引物，引物序列见表1，由吉林省库美生物科技有限公司合成。用A型病毒DNA提取试剂盒提取确诊患者疱疹液样本DNA，以其为模板进行PCR扩增。PCR 扩增条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃15 s，72 ℃ 30 s，共 30 个循环；72 ℃ 5 min。PCR 产物经磁珠法PCR产物纯化试剂盒纯化，送至吉林省库美生物科技有限公司测序，将测序获得VZV临床株的多个ORF（ORF1、12、16、17、21、22、37和54）核酸序列与已发表用于鉴定VZV 基因型的18 个SNPs 位点进行比对，当SNPs位点与代表毒株一致，判为同一基因型。

表1 VZV的基因分型引物Tab.1 Primers for genotyping of VZV

1.6 毒株鉴定 采用RFLP 技术。以1.5 项中提取的DNA 为模板，采用包含ORF38（69 349 位点呈现PstⅠ-）、ORF54（95 241 位点呈现 BglⅠ+）和 ORF62（106 262 位点呈现SmaⅠ+）酶切位点的引物进行PCR 扩增［15］。引物序列及 PCR 扩增条件同 1.5 项。PCR 产物采用磁珠法PCR 产物纯化试剂盒纯化，纯化产物分别经PstⅠ、BglⅠ和SmaⅠ酶酶切，酶切产物均经2%琼脂糖凝胶电泳分析，以鉴别临床株及疫苗株。

2 结果

2.1 血清样本的鉴定 59份血清样本效价均＞4，均为VZV 阳性。其中水痘病例血清样本14份（男性8份，女性6 份），男女比例1.33∶1；带状疱疹病例血清样本45份（男性19份，女性26份），男女比例1∶1.37。

2.2 VZV的基因分型 59份临床样本毒株与以Dumas为代表的Clade 1 型亲缘关系最远，仅有4～5 个SNPs 位点碱基相同，与以vOka 株为代表的Clade 2基因型亲缘关系最近。与Clade 2 型Oka 株序列比较，4份临床样本（Sample 1）与Clade 2 基因型完全匹配；4 份临床样本（Sample 2）存在 2 个 SNPs，分别为ORF1（SNP790）C→A突变和ORF12（SNP18 082）T→C突变；51份临床样本（Sample 3）发生ORF12（SNP18 082）T→C突变。判定59份临床样本均为Clade 2基因型。见表2。

表2 VZV基因分型比对结果Tab.2 Blast results for genotyping of VZV

2.3 毒株鉴定 VZV 疫苗株及临床株PstⅠ酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析，分别可见单一和2条基因条带，表明VZV 疫苗株在ORF38 目的片段上不存在PstⅠ酶切位点，临床株存在1 个PstⅠ酶切位点；VZV 疫苗株和临床株BglⅠ酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析，均可见2 条基因条带，表明在ORF54 目的片段上均存在1 个BglⅠ酶切位点；VZV 疫苗株和临床株SmaⅠ酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析，分别可见3 和2 条基因条带，表明VZV 疫苗株在ORF62 目的片段上存在2 个SmaⅠ酶切位点，临床株存在1 个SmaⅠ酶切位点。见图1。上述结果表明，59 株临床株的ORF38、ORF54和ORF62的酶切结果均为PstⅠ+BglⅠ+SmaⅠ-，不同于VZV 疫苗株 PstⅠ-BglⅠ+SmaⅠ+，因此确定在本次流行病学调查的临床样本不存在VZV 疫苗株致病的情况。

图1 RFLP鉴定结果Fig.1 Identification results by RFLP

3 讨论

本研究通过 18 个 SNPs 对 2021 — 2022 年长春市VZV 流行株进行基因分型，经分析VZV 临床株的核酸序列发现，与VZV疫苗株株核酸序列比较，临床株中存在 2 个新的 SNPs：ORF1（SNP790）C→A 和ORF12（SNP18 082）T→C，前者导致 ORF1 的第42 个氨基酸由谷氨酰胺突变为组氨酸，后者发生在ORF12 的第623 个氨基酸上，并未导致氨基酸发生变化。

ORF1 是VZV 编码的5 个无单纯疱疹病毒同源物的基因之一，编码1 个在其C-末端具有疏水结构域的膜蛋白［16］。有研究预测，ORF1蛋白的N-末端为跨膜结构域，定位于受感染细胞的细胞质和成熟病毒粒子的被膜区［17］。在一项关于全球范围VZV基因重组的研究发现，同样产生ORF1（SNP790）C→A 的临床样本，通过进化树分析突变后的VZV仍为Clade 2型［18-20］。ORF9～12组成的基因簇编码4种假定膜蛋白，并在大多数甲型疱疹病毒中高度保守［21-24］，其中，ORF12 通过激活P13 激酶／Akt 通路对所有周期进程进行调控［25］。ORF12在黑色素瘤和人类胚胎成纤维细胞VZV 复制中是不可或缺的，ORF12 的缺失对皮肤感染无影响，本研究结果表明，VZV 临床株ORF12（SNP18 082）T→C发生突变，突变后位点与Clade 1 型VZV 毒株一致。根据ORF22上5个SNPs位点比对结果，判断突变后的临床样本仍为Clade 2 型，与相关报道结果相符［3］。

RFLP 检测结果表明，虽然59 份临床样本为Clade 2 型，但其 ORF38、ORF54 和 ORF62 的酶切结果均为PstⅠ+BglⅠ+SmaⅠ-，不同于疫苗株PstⅠ-BglⅠ+SmaⅠ+，表明 2021 — 2022 年长春市未发生 VZV 疫苗株致病现象。本研究为VZV感染的防控提供了实验依据，但仍需持续对VZV的流行病学进行监测，了解当地流行株基因分型信息。