人免疫缺陷病毒广谱中和抗体的研究进展

张慧，邓婷婷 综述，李少伟，，顾颖， 审校

1.厦门大学公共卫生学院分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室，福建 厦门 361102；2.厦门大学生命科学学院国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，福建 厦门 361102

艾滋病（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）是由人免疫缺陷病毒1 型（human immunodeficiency virus type-1，HIV-1）和 2 型（HIV-2）感染引起的传染性疾病，其中HIV-1 的传播范围更广泛，截止2021 年，全球约有 3 800 万人感染 HIV-1，65 万人死于AIDS及其相关疾病［1］。尽管通过抗逆转录病毒疗法（antiretroviral therapy，ART）可有效降低AIDS的感染率和死亡率，但ART 需终身服药且药物的副作用较大，因此开发保护性疫苗和特异性药物是预防HIV-1 感染和治疗AIDS 的理想途径。HIV-1 疫苗的作用是能够刺激机体产生广谱中和抗体（broadly neutralizing antibodies，bNAbs），这类抗体可同时中和不同型别毒株，在预防HIV-1 感染及控制AIDS 进程中具有巨大应用潜力。近年，随着抗体分离技术和高通量B 细胞分析平台的发展，从人及免疫动物中相继筛选出更高效的bNAbs。本研究就HIV-1 bNAbs 的产生及获得、分类及特点、应用情况作一综述，以期为HIV-1 疫苗设计及AIDS 治疗方式提供参考。

1 HIV-1 bNAbs的产生及获得

目前，已筛选到的HIV-1 bNAbs 主要靶向CD4受体和HIV-1包膜糖蛋白（envelope glycoprotein，Env），其中Env 作为HIV-1 唯一的表面抗原，具有高达62%～79%的表面糖基化修饰和30%的病毒变异水平，病毒感染人体后持续变异，使机体难以产生针对多种变异株的 bNAbs［2-3］。早期的 HIV-1 bNAbs 主要来源于“精英患者”或慢性感染者，随着HIV-1 疫苗研究的进展，可从被动免疫动物体内筛选获得多种中和抗体（neutralizing antibodies，Nabs）和bNAbs。

1.1 来源于自然感染者的bNAbs 在HIV-1 自然感染的早期阶段，易产生中和特定毒株的抗体，这些抗体多靶向Env 上的一些优势表位，如高度可变的V3和V1V2 区［4］。随着感染过程中病毒持续发生突变，这些特异性中和抗体发生逃逸，推动了抗体在生发中心进一步成熟，形成 bNAbs［5］。bNAbs 的成熟需较长时间且发生率低，仅有10%～25%的患者在感染2～3 年后可检测到交叉中和抗体应答，且最终仅有1%～2% 的患者能产生 bNAbs［6-7］。HIV-1 bNAbs 通常具备一些共同特征，如高频体细胞超突变（somatic hypermutation，SHM）及较长的重链互补决定区3（third heavy chain complementarity determining regions 3，HCDR3）。大多数人类抗体重链存在15～20 个基因突变，而bNAbs 重链具有40～100 个基因突变，20%～30%的 SHM 频率［8］；人类抗体的 HCDR3 长度为 8～16 个氨基酸，而 HIV-1 bNAbs 的 HCDR3 长度达 20～36 个氨基酸［9］。但高频 SHM 和长 HCDR3 并不是HIV-1 bNAbs 所必需的特征，一些SHM 频率相对较低的抗体［如PG9（13%）／PG16（12%）］和HCDR3长度较短的抗体［如3BNC117（12）／VRC01（14）］也具有相对广谱和强效的中和活性［6］。这些bNAbs 的发现及其与Env 复合物的结构解析为抗体治疗提供了候选分子，也为HIV-1 疫苗设计提供了结构上的支撑。

1.2 来源于免疫动物的交叉中和抗体及bNAbs

由于HIV-1 bNAbs 的上述特征及Env 高度变异性和糖基化特点，前期研究认为，被动接种Env 难以在动物及人体内诱导产生异源Tier 2中和抗体应答，更难以产生 bNAbs 应答［10］。随着 HIV-1 抗原设计策略、免疫策略及疫苗佐剂的丰富，稳定的类天然三聚体（SOSIP、UFO、NFL）、HIV-1 类病毒样颗粒、核酸疫苗等抗原形式相继问世，研究者成功在小鼠体内诱导产生了交叉中和抗体应答，并在兔、非人灵长类动物（non-human primates，NHP）及奶牛体内筛选获得了 bNAbs［11-16］。

1.2.1 来源于小型哺乳动物的交叉中和抗体及bNAbs一项以编码类天然Env三聚体（BG505.MD39 gp140）的DNA 作为免疫原的研究，成功在BALB／c 小鼠体内诱导产生了针对自体Tier 2 毒株的中和抗体应答［17］。XU等［18］将高度保守的融合肽（fusion peptide，FP）表位展示在钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）表面，通过FP-KLH 初免及类天然 Env三聚体加强免疫的方式，在C57BL／6小鼠体内诱导产生了交叉中和抗体应答，并筛选到能中和31%毒株（共检测208 种毒株）的鼠源交叉中和抗体2712-vFP16.02。以往研究较少在小鼠体内诱导出Tier 2中和抗体，原因可能在于使用类天然三聚体免疫时，其基底部非中和表位的暴露优先刺激小鼠产生非中和抗体，且小鼠的HCDR3 较短（平均11 个氨基酸），较难穿过Env表面的聚糖层结合抗原表位［19-21］。

与小鼠比较，在兔体内更易诱导自体Tier2 中和抗体，兔源抗体主要依靠轻链互补决定区3（L-chain third complementarity determining region 3，LCDR3）与免疫原接触而发挥中和作用，且兔源抗体的LCDR3平均长度为14 个氨基酸，比人源抗体多4 个氨基酸［22-23］。DUBROVSKAYA 等［13］用以脂质体为载体的聚糖缺失Env 三聚体初免及聚糖恢复Env 三聚体加强的方式，在兔体内诱导出中和宽度分别为87%和25%的1C2 和E70 抗体，两株抗体均具有8%的低SHM 频率，HCDR3 分别为 20 和 15 个氨基酸。小型哺乳动物作为免疫原初期评价实验的动物模型，能够在其体内诱导产生交叉中和抗体具有突破性意义，表明通过抗原设计及免疫策略的优化可进一步提升疫苗的有效性。

1.2.2 来源于NHP 的交叉中和抗体及bNAbs NHP体内诱导出的bNAbs 与人源bNAbs 的特征最相似，但大部分感染猿猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）的NHP只能存活2～3年，而bNAbs的形成至少需要5 年，因此较难在NHP 体内分离获得 bNAbs［24］。GAO 等［25］从感染 SIV 6 年的 NHP 体内分离得到了能中和54%毒株（共检测208 种毒株）的中和抗体 J038，其 HCDR3 含有 18 个氨基酸，SHM 频率为20%。另一项研究通过FP-KLH 和Env 三聚体联合免疫的方式在NHP体内也诱导出了可中和59%毒株（共检测208种毒株）的中和抗体DFPH-a.01［26］。NHP 作为最适合评估HIV-1 疫苗保护功效的动物模型，能够在其体内诱导出bNAbs，可为疫苗进入临床研究提供重要依据。

1.2.3 来源于奶牛的交叉中和抗体及bNAbs 与小鼠、兔及NHP 比较，奶牛来源的抗体具有平均26 个氨基酸的超长HCDR3，其中10%～15%抗体的HCDR3长达70个氨基酸，其最短的HCDR3也长于人类和小鼠抗体的 HCDR3［27］。研究发现，奶牛 bNAbs 的成熟周期比人更短，初次免疫42 d 后牛血清的广谱中和性为20%，至第381天可提高至96%，最终筛选获得了广谱性高达72%（共检测117 种毒株）的中和抗体NC-Cow1 和中和效力更好的 MEL-1872［27-29］。奶牛bNAbs 具有产生时间短、广谱性强的特点，可为感染HIV-1的治疗提供新的选择。

2 HIV-1 bNAbs的分类及特点

Env 可在福林酶的作用下裂解为gp120 和gp41分子，因此根据bNAbs 与Env 的结合表位可将目前分离获得的 HIV-1 bNAbs 分为 3 类：靶向 gp120 的bNAbs、靶向 gp41 的 bNAbs、靶向 gp120-gp41 交界面的bNAbs。

2.1 靶向gp120 的bNAbs gp120 位于病毒膜外侧，由 5 个保守区（C1～C5）和 5 个可变区（V1～V5）组成，主要包括 4 个 bNAbs 表位：V1V2 区、V3 区、CD4结合位点（CD4 binding site，CD4bs）、gp120 沉默面（silence face，SF）。

V1V2表位位于gp120顶端，其表面被聚糖遮蔽，因此bNAbs 在结合该位点时，需先使用较长HCDR3穿透聚糖屏蔽的Env，随后与V1V2 和N156／N160聚糖形成的构象表位相互作用，其中N160 聚糖是V1V2 表位抗体结合的重要位点［30］，该表位 bNAbs 具有较长的HCDR3（28～36 个氨基酸）和较低的SHM（12%～18%），其中广谱性较好的bNAbs 包括PG9、PG16 和 PGT145，最高中和宽度可达 80%［31］。对该表位最有效抗体VRC26.25 的识别位点进行表征发现，VRC26.25同时具有PG6和PGT145结合位点，且N160 聚糖缺失不会影响VRC26.25 的中和作用，进一步丰富了该表位bNAbs的研究［32］。

V3 聚糖表位与V1V2 表位相邻，保守的线性基序GDIR（G324-D325-I326-R327）和N332聚糖是该表位bNAbs 的主要结合位点。根据不同胚系基因可将V3 区 bNAbs 分为多个家族，包括 PGT121-124／PGT133-134／10-1074、PGT125-128／PGT130-131和PGT135-137，这些抗体均可与N332 聚糖相互作用［33］。与上述bNAbs不同，2G12仅与V3表位聚糖结合，且其重链结构域相互交换，进一步提高了与聚糖的亲和力［34］。在感染HIV-1 1 年的婴儿体内发现靶向V3区的抗体BF520.1，与成人bNAbs比较，BF520.1以2%的SHM 即可达到成熟抗体的中和宽度，且BF520.1 抗体的功能活性不依赖HCDR3，与LCDR1中的氨基酸取代更相关［35］。

CD4bs表位是gp120 上高度保守的表位，该表位介导病毒与CD4 分子的结合，引起Env 三聚体的变构，从而与靶细胞发生融合［36］。靶向CD4bs 表位的bnAbs模拟CD4分子与gp120的结合模式阻断病毒与CD4 受体的结合。该表位bNAbs 主要使用VH1-2 和VH1-46 两种胚系基因，其中VH1-2 胚系基因LCDR3含有5 个氨基酸的bNAbs 称为VRC01 类抗体，这类抗体的中和宽度达96%以上，如VRC01、N49 谱系、VRC07-523［37-39］。与使用 VH1-2 胚系基因的 bNAbs比较，使用VH1-46 胚系基因的bNAbs 中和效力和宽度较低。研究发现，1-18 bnAbs 与VRC01 类抗体的广谱性相当，可中和97%毒株且可限制病毒逃逸，保持对变异病毒的中和活性［40］。CD4bs 表位的bNAbs中和广度和效力均较强，且重链和轻链可变区基因具有高频SHM（24%～32%）的特点，设计能诱导出VRC01 类抗体的疫苗分子及免疫策略成为HIV-1 疫苗研发的热点。

SF 与V3 聚糖位点相邻，是gp120 上高度糖基化的表位，目前发现靶向SF 表位的抗体仅有VRCPG05 和 SF12，这 2 株抗体与 Env 的结合均与 N262、N295 和N448 3 个聚糖位点形成表位相关，但与Env的结合角度不同，且SF12 还需与gp120 上的蛋白质结合，这可能是SF12广谱性（62%）较VRC-PG05（27%）更高的原因［41-42］。见表1。

2.2 靶向 gp41 的 bNAbs gp41 由胞外区、跨膜区、胞质区3部分组成。已报道靶向gp41的bNAbs仅与FP和近膜端区（membrane-proximal external region，MPER）2个高保守表位相互作用。

gp41 N-末端15～20 个疏水氨基酸构成的FP 表位是病毒进入靶细胞过程中的关键组成部分，也是gp41 上易受bNAbs 识别的保守位点。VRC34.01 和ACS202 为该表位广谱性和中和效力较好的bNAbs，两者均可识别FP 上第512～519 位氨基酸和N88 聚糖位点形成的1 个连续表面，中和宽度分别为49%（共检测208 种毒株）和45%（共检测75 种毒株）［43-44］。ACS202的HCDR3包含22个氨基酸且含有能够协助抗体与FP结合的YYYY基序，而VRC34.01的HCDR3仅包含13 个氨基酸且不包含YYYY 基序，表明即使是同表位的抗体，结合方式和特征也有所不同［44］。

MPER 是 gp41 上一段由 28 个氨基酸（656～683）组成的高度保守表位，该表位的bNAbs 具有较长的HCDR3（20～23），且中和宽度和中和效力良好，其中10E8 抗体不仅是该表位最有效的抗体，还无自身反应性，比其他MPER 表位的bNAbs 具有更高的研究和应用价值［45］。最近分离获得的MPER表位抗体有VRC42.01 和LN01，两者与4E10、10E8等抗体具有相似的结合位点，中和宽度可达90%以上［46-47］。LN01 抗体除了与 MPER 表位相互作用外，还需与跨膜区的部分氨基酸结合才能发挥中和作用［47］。见表1。

2.3 gp120-gp41 交界面的bNAbs 与上述几个表位不同，gp120-gp41 交界面跨越 gp120 和 gp41 2 个亚基，主要包括gp41 和gp120 上与CD4bs 相邻的聚糖位点。靶向gp120-gp41 交界面的抗体有35O22、8ANC195和PGT151，3株抗体的中和宽度分别为62%（共检测181种毒株）、68%（共检测120种毒株）和66%（共检测117种毒株），与其他表位的抗体相同，gp120-gp41 交界面的 bNAbs 也具有高频 SHM 的特点［48-49］。在兔体内诱导出gp120-gp41交界面的bNAbs 1C2，可结合 gp41 和 gp120 上的 N88 聚糖，而与 35O22 抗体不同，1C2 在与Env 结合后会破坏三聚体稳定性，揭示了bNAbs另一类的中和机制［13］。见表1。

表1 HIV-1 bNAbs的汇总表Tab.1 Summary of HIV-1 bNAbs

3 bNAbs的应用

随着抗体分选技术的发展，从人体内分离出大量bNAbs。通过对这些bNAbs 的特点、成熟方式、表位及中和机制的研究，更深入地了解了机体的免疫应答机制，有助于指导HIV-1 的疫苗设计和AIDS 的预防治疗。

3.1 基于bNAbs 的疫苗设计 有研究设计了能稳定Env三聚体融合前构象的免疫分子，并成功在兔体内诱导产生Tier 2 自体中和抗体应答，但难以诱导bNAbs 的产生［50-51］。bNAbs 通常来源于特定的谱系，经多轮亲和力成熟发展成为bNAbs，但bNAbs的前体B细胞在感染者体内非常稀有，以VRC01类bNAbs为例，其前体 B 细胞在 B 细胞库中占比仅为 1／4 000 000［52］。因此，通过已知的bNAbs 序列及结构信息推测其前体B 细胞基因，设计前体B 细胞靶向的免疫原，从而有针对性地刺激这些bNAbs 前体B 细胞的产生和成熟，将极大提高免疫原诱导中和抗体应答的效率。这类靶向bNAbs 种系的疫苗设计大多是通过酵母展示平台及哺乳动物细胞表面展示技术筛选与bNAbs前体具有结合亲和力的分子作为免疫原。eOD-GT8 60mer是将与VRC01 类bNAbs 前体具有高亲和力的gp120分子工程外域展示在纳米颗粒上的免疫原，能在基因敲入小鼠体内诱导出VRC01 类前体B 细胞［53-54］。BG505-11MUT 和 BG505 SOSIP GT1.1 均是在SOSIP 设计的基础上，引入突变和缺失所构建的免疫原，可在基因敲入小鼠体内诱导特定抗体的前体 B 细胞，其中 BG505-11MUT 可刺激 PGT121 类前体B细胞的产生，而BG505 SOSIP GT1.1可同时诱导多种bNAbs 的前体B 细胞，包括PGT121 类和VRC01类前体 B 细胞［55-56］。BG18 与 PGT121 均为 V3 聚糖表位的抗体，因此在BG505-11MUT 免疫原的基础上，筛选出的与BG18 类前体具有高亲和力的免疫原N332-GT2 Env，可在BG18种系基因敲入小鼠体内诱导HCDR3依赖的BG18类前体B细胞［57］。目前eODGT8 60mer 和 BG505 SOSIP GT1.1 正在进行Ⅰ期临床试验［10］。

bNAbs 谱系需经过SHM、基因片段插入或缺失以达到亲和力成熟，同时病毒也会在选择压力下发生突变，进一步刺激抗体成熟，因此在成功诱导出bNAbs前体B细胞后，需根据bNAbs谱系进化的时间轴设计免疫原以逐步诱导体内bNAbs 成熟［58］。CH103 为靶向CD4bs 表位的bNAbs，研究者选择了4种与CH103 谱系具有高亲和力的CH505 gp120 Env进行序贯免疫，即用CH505 初始传播毒株（transmitted-founder virus，TF virus）gp120 初免，再用 3 种具有不同突变位点的CH505 gp120 Envs 免疫，以模拟CH103 谱系的成熟，最终在NPH 体内诱导出中和抗体效应，但尚未诱导出 bNAbs［59］。CH235 和 DH270的抗体活性与SHM 中的不可能突变（在较少发生SHM的位点发生的突变）密切相关，因此要引发这两种谱系的抗体需要刺激不可能突变的发生，从而诱导抗体成熟。SAUNDERS 等［60］在 SOSIP gp140 的基础上，通过引入G458Y突变和聚糖缺失，分别构建了CH505 M5.G458Y gp140 和 CH848 10.17DT 两 种 免疫原，最终在bNAbs 前体基因敲入小鼠体内诱导了具有K19T不可能突变的CH235类抗体和具有G57R、S27Y不可能突变的DH270类抗体。

3.2 基于bNAbs 的预防与治疗 bNAbs 可特异性识别HIV-1，具有预防感染和抗病毒的作用，因此bNAbs 可用于HIV-1 治疗和被动预防。VRC01 作为广谱性较好的抗体，在临床试验中具有良好的安全性和稳定的药代动力学，但将其应用于HIV-1 的高危人群中，仅能产生对VRC01敏感毒株的预防，对突变毒株及耐药毒株无保护作用，在急性感染者中最高可产生42周的病毒抑制作用［61-62］。单一表位的抗体免疫广谱性较差且在机体内的半衰期较短，不能实现长效保护和病毒抑制。为克服这些缺点，一方面，通过多表位抗体联合免疫提高广谱性，包括不同表位bNAbs 的联合免疫、双特异性抗体及三特异性抗体的构建。CD4bs 表位抗体3BNC117 和V3 表位抗体10-1074联合应用可有效抑制病毒复制，产生长达 4 个 月 的 保 护［63］。 BiIA-SG 将 靶 向 V3 聚 糖 的PGT128 抗体与靶向CD4 分子的Hu5A8 抗体可变区串联构成双特异性抗体，可有效预防和控制NPH 体内的 SHIV 感染［64-65］。VRC01／10E8v4-PGDM1400三特异性抗体联合 CD4bs、V1V2、MPER 3 个不同表位，能在NPH体内产生比单一抗体更强效的保护，目前正在进行临床试验［66］。另一方面，通过在抗体的Fc 段引入 M428L 和 N434S 突变（LS）可增强 IgG 与 Fc受体的结合，从而延长抗体半衰期，如VRC01-LS 抗体比 VRC01 的半衰期长 4 倍以上［67］；同时也可将抗体基因整合至腺相关病毒载体中，形成重组腺相关病毒载体疫苗，实现抗体的持续递送，已有PG9 和VRC07 两种抗体得到应用并进入临床试验，初步试验表明，可在受试者的肌肉或血清中检测具有中和活性的 VRC07 抗体［68-69］。在 HIV-1 感染的治疗中，将 bNAbs 与抗逆转录药物、Toll 样受体 7（Toll like receptor 7，TLR7）激动剂等药物联用可延长病毒的反弹时间，同时可减轻单独使用抗逆转录药物的副作用［70-72］。但在bNAbs 治疗后期易出现病毒逃逸现象，降低治疗效果，因此抗体疗法还需要探索最适的抗体或药物的组合，以达到最佳治疗效果。与抗逆转录药物治疗比较，bNAbs 的生产成本高、需通过注射给药等缺点也可能会限制其在临床上的应用［73］。

4 小结与展望

随着bNAbs 分离技术的进步，与早期筛选的bNAbs（2G12 等）比较，目前筛选出的bNAbs 中和宽度和效力均有所提高，并已应用至预防和治疗HIV-1感染的临床试验中。基于bNAbs 的免疫原设计，部分免疫原分子可靶向bNAbs 谱系的前体B 细胞，但暂时还未在人体内产生bNAbs，寻找更加有效的免疫原仍是疫苗设计的难点。在被动免疫的临床试验中，机体可表现出一定的抗感染能力，但这种抗感染能力对不同毒株的作用有限，提高抗体对多种毒株的抗感染能力需进一步深入研究。将bNAbs 应用至HIV-1 感染的治疗中发现，机体易产生病毒逃逸，将抗体与抗转录药物或TLR7 激动剂等药物联用可对病毒产生长期抑制，减少病毒逃逸，因此多种治疗方式联用可能成为未来治疗HIV-1感染的趋势。