十八叔胺修饰硅胶色谱固定相制备及分离性能研究

车轩，刘德禄，乔晓强

(1.河北省生态环境监测中心，河北 石家庄 050000；2.河北大学 药学院，河北 保定 071002)

生物膜是维持细胞结构和生理机能的关键元素.自1972年辛格和尼克森首次报道了细胞膜结构的流体镶嵌模型后，人们对细胞膜及其各组成部分的作用研究更加深入[1].生物膜中膜脂和膜蛋白质种类繁多，其中膜脂约占细胞膜质量的50%，主要类型包括磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)等[2-3].同时，磷脂分子还具有多种多样的异构体，如sn位置同分异构体、双键位置异构体、双键顺反同分异构体、R/S手性对映体等，这进一步增加了磷脂分离分析的挑战性[4].

早期的磷脂分析方法常采用络合光度法和比色法对磷脂总量进行检测和质量分析，该方法的缺点在于不能实现单一组分的分析检测[5-6].之后，薄层色谱法被开发用于磷脂的分离分析，具有操作简便和样品处理量大等优点，一直被沿用至今.薄层色谱法主要缺点是其仅对同一类别的磷脂具有分离效果，无法对单一类别中磷脂分子种属进行分离分析.此外，薄层色谱分析过程中待分析磷脂分子会完全暴露于空气中，导致部分不饱和脂肪酸氧化，使结果产生偏差[7].高效液相色谱是近年来广泛采用的磷脂分离分析技术.在磷脂分离过程中，不同的色谱模式可扮演不同的作用.不同类别的磷脂分子多采用正相色谱(NPLC)进行分离；对于同一类不同种属的磷脂往往采用反相色谱(RPLC)进行分离[8-9].近年来，混合模式色谱受到广泛关注，其具有分离选择性高、负载能力强、分离效率高等优点.通过在同一根色谱柱上设计多种分离模式，可在不同模式下完成多种类型和结构磷脂的高效分离分析[10-11].因此，研究新型混合模式色谱固定相可为磷脂的高效分离提供新的途径.

本文采用含有环氧基团的硅烷化试剂对球形多孔硅胶进行硅烷偶联反应，再利用十八叔胺(DMOA)结构中的叔胺对环氧基进行开环反应，制备了十八叔胺极性嵌合色谱固定相(SiO2-DMOA)，探讨了填充SiO2-DMOA色谱柱的保留机制、分离性能和分离选择性，进一步将其应用于大豆卵磷脂和肺腺癌细胞磷脂的分离分析.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

配备有ELSD6000蒸发光散射检测系统(美国奥泰科技有限公司)的P230II高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)；Milli-Q纯化系统(法国Millipore公司)；STA449C热重分析仪(德国耐驰公司)；Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；高速离心机(河北标普科学器材有限公司).

球形多孔硅胶粒径5 μm，孔径12 nm,购自日本Daisogel公司；3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)、蒽、三亚苯、邻苯二胺、对乙酰氨基酚(北京伊诺凯科技有限公司)；DMOA(上海毕得医药科技股份有限公司)；对氨基苯甲酰胺、烟酰胺、2-碘乙酰胺(阿法埃莎试剂有限公司)；丁苯、乙苯、苯、丙苯(天津光复精细化工研究所有限公司)；苯甲腈、2-苯乙醇、苯甲醚、萘、对甲苯酚、4-叔丁基苯酚、对氯苯酚(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；2,6-二甲基苯胺、苯胺(上海阿达玛斯试剂有限公司)；三氯甲烷、甲苯、正己烷、环己醇、三乙胺(天津市大茂化学试剂厂)；大豆卵磷脂(威海恩威万生物科技有限公司)；冰乙酸、三乙胺、异丙醇、色谱正己烷(天津市科密欧化学试剂有限公司)；二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)(美国Sigma-Aldrich化学试剂公司)；二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)(北京百灵威科技有限公司)；色谱纯乙腈(ACN)、甲醇(天津赛孚瑞科技有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 SiO2-DMOA色谱固定相的制备

SiO2-DMOA固定相的制备分为环氧基修饰二氧化硅(SiO2-GPTMS)的制备和SiO2-DMOA的制备(图1).

图1 SiO2-DMOA固定相制备示意

SiO2-GPTMS制备：首先称取2.4 g干燥过夜的球形硅胶置于250 mL圆底烧瓶中，依次加入30 mL无水甲苯、2.4 mL GPTMS和300 μL三乙胺重悬，反应体系摇匀后，N2氛围下95 ℃加热回流24 h.待反应完毕后，用甲苯、乙腈和甲醇依次洗涤2遍以洗去杂质，抽提后置于80 ℃烘箱中干燥过夜，获得SiO2-GPTMS.

SiO2-DMOA制备：称取2.4 g SiO2-GPTMS置于250 mL圆底烧瓶中，依次加入30 mL的甲醇和12 mL的DMOA重悬，充分混匀，N2氛围下50 ℃加热回流2 h.反应结束后，用大量甲醇洗去反应体系中的杂质，置于80 ℃烘箱中烘干24 h，获得SiO2-DMOA固定相.

1.2.2 色谱柱的填充

SiO2-DMOA色谱柱采用高压匀浆法填装.称取2.0 g的SiO2-DMOA固定相置于100 mL烧杯中，将SiO2-DMOA色谱固定相与匀浆液混合，超声处理2 s使其均匀分散，匀浆液按照氯仿-环己醇体积比为3∶7进行配置.将150 mm× 4.6 mm的空柱管与匀浆罐连接好，并将混悬液倒入匀浆罐中.调节压力使其上升至35 MPa，加压液甲醇-异丙醇(体积比为1∶1)会随着管路流过匀浆罐下方的色谱柱，在此压力下维持30 min，缓慢降低压力，静置30 min.将柱管卸下后装好筛板和柱头，随后用乙腈冲洗色谱柱，待使用.

1.2.3 色谱分离条件

SiO2-DMOA色谱柱的性能评价采用P230II高效液相色谱系统进行.小分子物质采用UV230Ⅱ紫外检测器，在柱温28 ℃条件下以乙腈-水为流动相，1.0 mL/min的流速等度洗脱进行测试，进样量为5 μL.多环芳烃类和苯酚类物质检测波长选用254 nm，烷基苯类、苯衍生物类、苯胺类和酰胺类物质紫外检测波长选用214 nm.磷脂样品的检测采用ELSD6000蒸发光散射检测器，色谱流速为1.0 mL/min，检测器漂移管温度为100 ℃，气体流速为2.0 L/min，进样量为10 μL.

1.2.4 标准样品的制备

所有小分子物质均采用乙腈或水溶解、过膜、冷藏备用，苯酚类、酰胺类、苯胺类和苯衍生物类样品质量浓度控制在60～100 μg/mL；烷基苯类和多环芳烃类物质质量浓度控制在200～300 μg/mL.DMPC、DPPC和DSPC均采用三氯甲烷-甲醇(体积比为1∶1)配制，DPPG和DPPE采用三氯甲烷-甲醇(体积比为3∶1)配制，质量浓度控制在0.4～0.8 mg/mL.

1.2.5 实际样品的制备

对于大豆卵磷脂样品，首先去除胶囊.将100 mg大豆卵磷脂样品用10 mL正己烷-异丙醇(体积比为1∶1)稀释溶解，样品在4 ℃下超声10 min，经0.45 μm微孔膜过滤，以备后续使用[12].肺腺癌细胞(由河北大学附属医院提供)膜脂的提取方法参照Folch法[13].

2 结果与讨论

2.1 SiO2-DMOA固定相表征

首先，SiO2、SiO2-GPTMS和SiO2-DMOA固定相采用傅里叶变换红外光谱仪进行表征.图2a为SiO2、SiO2-GPTMS和SiO2-DMOA固定相在4 000～400 cm-1内的红外光谱图.图2a中可以明显看到在SiO2、SiO2-GPTMS和SiO2-DMOA的红外谱图中1 100 cm-1处的强吸收峰，SiO2-GPTMS和SiO2-DMOA是以二氧化硅为基底材料，所以此处峰可以认定为由Si—O的伸缩振动所引起.相比于SiO2-GPTMS，可以在SiO2-DMOA固定相中观察到2 930 cm-1和2 850 cm-12处吸收峰，这属于DMOA结构中典型的甲基和亚甲基的特征峰.

此外，对SiO2、SiO2-GPTMS和SiO2-DMOA固定相进行热重分析.如图2b所示，在温度上升至800 ℃时，SiO2几乎没有质量损失.SiO2-GPTMS在400 ℃质量损失加剧，可以归于SiO2-GPTMS表面键合硅烷化试剂损失导致.SiO2-DMOA色谱固定相大约在170 ℃开始第1次发生质量损失，这可能是SiO2-DMOA色谱固定相表面最外层键合的DMOA损失导致的，SiO2-DMOA色谱固定相在400 ℃开始第2次质量损失，这与SiO2-GPTMS的质量损失相似.在800 ℃时，与SiO2相比，SiO2-GPTMS和SiO2-DMOA质量分别损失了13.5%和17.0%.上述结果可证明SiO2-DMOA固定相已成功制备.

图2 SiO2、SiO2-GPTMS和SiO2-DMOA的红外(a)和热重(b)分析

2.2 保留机制

首先选取甲苯、乙苯、丙苯、丁苯对SiO2-DMOA色谱柱的保留机制进行考察.从图3a可以看出，当洗脱液中ACN体积分数从40%增加到90%时，4种烷基苯类物质的保留呈下降趋势，保留因子从7.83下降到0.05，表现出典型的反相色谱保留机制.此外，SiO2-DMOA固定相表面存在季胺基团，因此SiO2-DMOA色谱柱可能存在亲水保留机制.进一步选取2-碘乙酰胺、对氨基苯甲酰胺和烟酰胺考察了SiO2-DMOA色谱柱的保留机制.如图3b所示，随着洗脱液中H2O体积分数从1%增加到40%，2-碘乙酰胺、对氨基苯甲酰胺和烟酰胺的保留逐渐下降，表现出典型的亲水色谱保留机制.因此，SiO2-DMOA色谱柱具有反相/亲水混合模式保留机制.

流动相：乙腈-水；检测波长：214 nm；流速：1.0 mL/min

2.3 SiO2-DMOA色谱柱分离性能

由于SiO2-DMOA色谱柱具有亲水和反相混合模式保留机制，选取亲水性酰胺类物质考察了SiO2-DMOA色谱柱在亲水模式下的分离性能；选取疏水性苯胺类、烷基苯类、苯衍生物类、苯酚类和多环芳烃类物质探究了SiO2-DMOA色谱柱在反相模式下的分离性能.

首先考察了SiO2-DMOA色谱柱对酰胺类和苯胺类物质的分离选择性.图4a为2-碘乙酰胺、对氨基苯甲酰胺和烟酰胺的色谱分离图.以乙腈-水(体积比为99∶1)进行洗脱，3种物质可在4 min内达到基线分离，分离度分别为2.35和2.44，且具有良好的峰形，拖尾因子为0.97～1.09.2-碘乙酰胺、对氨基苯甲酰胺和烟酰胺的理论塔板数分别为72 000、71 200和64 400 N/m.苯胺、邻苯二胺和2,6-二甲基苯胺3种碱性的苯胺类物质色谱分离结果如图4b所示，3种物质在3 min内可达到基线分离，其中邻苯二胺的理论塔板数可达77 100 N/m.

流动相：a.乙腈-水(体积比为99∶1)；b.乙腈-水(体积比为56∶44)；流速：1.0 mL/min；检测波长：214 nm

进一步选用烷基苯和苯衍生物类物质考察了其分离选择性.对于烷基苯类物质，如图5a所示，甲苯、乙苯、丙苯和丁苯在SiO2-DMOA色谱柱中的保留随着疏水性增强而增加，4种化合物在6 min内能够分离，理论塔板数依次为66 700、70 600、72 800、76 600 N/m，其分离度依次为2.93、4.01和4.63.如图5b所示，以ACN-H2O(体积比为55∶45)作为洗脱液，在4 min内3种苯衍生物可实现基线分离，其出峰依次为2-苯乙醇、苯甲腈和苯甲醚，分离度分别为2.9和2.55，拖尾因子依次为1.0、0.96和0.94，理论塔板数均在65 000 N/m以上.

流动相：a.乙腈-水(体积比为60∶40)；b.乙腈-水(体积比为55∶45)；流速：1.0 mL/min；检测波长：214 nm

最后，选取苯酚类和多环芳烃类物质考察了SiO2-DMOA色谱柱的分离性能.如图6a所示，以ACN-H2O(体积比为70∶30)作为洗脱液，4种苯酚类物质在4 min内能够实现分离，出峰顺序依次为对乙酰氨基酚、对甲酚、对氯苯酚和4-叔辛基苯酚，分离度均在3.57以上，最高理论塔板数可达74 700 N/m.3种多环芳烃，萘、蒽和三亚苯的分离结果如图6b所示，上述物质可以在5 min内达到基线分离且峰形良好，拖尾因子为0.88～0.95，分离度均在5.6以上，最高理论塔板数为81 100 N/m.

流动相：a.乙腈-水(体积比为70∶30)；b.乙腈-水(体积比为78∶22)；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm

2.4 SiO2-DMOA色谱柱用于磷脂分离分析

不同类别磷脂结构上的差异主要表现为头部基团极性的差异，在分离时主要采用正相色谱模式.基于SiO2-DMOA色谱柱具有反相/亲水混合模式保留特性，首先采用不同类别的磷脂标准品考察了SiO2-DMOA色谱柱对混磷脂样品的分离选择性.如图7a所示，以具有相同烷基侧链的磷脂DPPG、DPPE和DPPC为样品，能够在10 min内实现分离，其出峰顺序依次为DPPG、DPPE和DPPC.

进一步将SiO2-DMOA色谱柱应用于不同酰基侧链长度PC种类的分离.如图7b所示，以甲醇-乙腈(体积比为40∶60)为洗脱液，DMPC、DPPC和DSPC在17 min内实现基线分离，且峰形良好，并没有明显拖尾现象.DMPC、DPPC和DSPC的差异主要表现为2条酰基侧链含碳数目的不同，其尾部含碳数目分别为13、15和17.因此3种PC在SiO2-DMOA色谱柱上的洗脱顺序依次为DMPC、DPPC和DSPC.

流动相:a.A-甲醇(体积比为50∶50)，其中A相为异丙醇-水-正己烷-冰乙酸-三乙胺(体积比为81∶14∶5∶1.5∶0.08)；b.甲醇-乙腈(体积比为40∶60)；流速：1.0 mL/min；ELSD检测器

大豆卵磷脂是一种典型的植物提取磷脂，已经被证实可以通过影响血管舒张和抑制一种参与调节血压的关键酶来降低高血压的风险.此外，大豆卵磷脂还可以改善血糖和血脂，因此在营养补充剂市场上广受欢迎.大豆卵磷脂是一种复合脂类样品，主要由PC、PE和PI以及其他次要成分组成[14-15].快速高效的大豆卵磷脂分离检测方法对大豆卵磷脂的质量监测和质量控制尤为重要.进一步采用大豆卵磷脂提取样品考察了SiO2-DMOA色谱柱对复杂磷脂样品的分离性能.图8a为以A-甲醇(体积比为50∶50)为流动相的色谱分离图，从图8a中可以看到，在12 min内共可以观察到10个色谱峰，显示了良好的分离性能.

流动相:A-甲醇(体积比为50∶50)，其中A相为异丙醇-水-正己烷-冰乙酸-三乙胺(体积比为81∶14∶5∶1.5∶0.08)；流速：1.0 mL/min；ELSD 检测

随着社会的发展，吸烟越来越年轻化，首次吸烟的年龄也在逐渐缩小.肺癌是目前病死率最高的恶性肿瘤之一，而肺腺癌是最常见的肺癌类型之一.值得一提的是在肺癌发病率研究中发现，不仅吸烟者的发病率高，吸二手烟患者的发病率也在逐年增高[16-17].基于SiO2-DMOA色谱柱对磷脂良好的分离效果，进一步将SiO2-DMOA色谱柱用于提取的肺腺癌细胞膜中磷脂组分的分离分析.如图8b所示，肺腺癌细胞膜磷脂提取物在12 min内大致可观察到11个色谱峰.上述结果进一步证实SiO2-DMOA色谱柱对复杂磷脂样品具有良好的分离选择性.

3 结论

以十八叔胺DMOA为功能单体，利用环氧-叔胺亲核开环反应，制备了极性嵌合的SiO2-DMOA色谱固定相.填充SiO2-DMOA色谱柱显示了典型的反相/亲水混合模式保留特征，并可实现亲水性酰胺类和疏水性烷基苯类等物质的高效分离分析，其最高柱效可达81 100 N/m.该色谱柱也可实现不同磷脂类别和种类的分离，并可有效分离大豆卵磷脂和肺腺癌细胞中的磷脂组分，在磷脂分析中具有良好的分离潜力.