散结通脉方对脂质代谢相关蛋白表达及动脉粥样硬化的影响

李晓辉，李洪禹，成光宇，李双娣，刘爱东*

（1.河南中医药大学第一附属医院，郑州 450000；2.长春中医药大学附属第三临床医院，长春 130117；3.长春中医药大学附属医院，长春 130021）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病的主要病因，其特征是大中型血管中形成脂质斑块。有报道指出与年龄相关的动脉粥样硬化是所有死亡的40%的假定原因，也是老年人死亡的主要原因[1]。根据2017 年全球疾病负担研究显示，LDL-C 水平升高仅次于高血压和高钠饮食，是中国心血管疾病的第三大归因危险因素[2]。而巨噬细胞过度摄取ox-LDL 或胆固醇流出受阻形成大量的泡沫细胞是动脉粥样硬化的早期事件。所以调节胆固醇的代谢平衡是抗动脉粥样硬化的首要目标[3]。多项研究发现传统中医药通过调节脂质代谢在预防和治疗动脉粥样硬化方面发挥了重要作用，且安全性较高，及在远期疗效方面更有优势[4-7]。散结通脉方具有清化痰浊，化瘀利水之功，在改善血脂水平、逆转斑块及改善稳定型心绞痛的症状及预后方面取得了良好的疗效[8-9]。本研究在前期临床研究的基础上，用高脂饲喂ApoE-/-小鼠以建立动脉粥样硬化模型，初步探索散结通脉方调节脂质代谢及抗动脉粥样硬化的作用机制。

1 实验材料

选取SPF 级7 周龄健康雄性C57BL/6Cnc 小鼠，及以C57BL/6Cnc 小鼠为背景SPF 级7 周龄雄性ApoE-/-小鼠；体质量20～24 g。购于北京维通利华实验动物科技有限公司[许可证号：SCXK（京）2016-0006]。于吉林大学基础医学院SPF 级屏障实验室进行饲养。普通维持饲料由吉林大学基础医学院动物房提供，高脂饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供（型号D12079B）。散结通脉方（长春中医药大学附属医院实验研究中心提供），阿托伐他汀钙片（辉瑞制药有限公司，国药准字H20051407，规格10 mg），苏木素、伊红（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），β-Actin 抗体（北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-0061R）；ABCA1 抗体、ABCG1 抗体、SOX9 抗体、CD36 抗体、Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（美国Abcam 公 司，货 号：ab7360、ab217023、ab185966、ab124515、ab205718），RNA 引物（美国Invitrogen 公司提供）等。全自动生化分析仪（日本日立公司），自动包埋机 EG11OH（德国LEICA 公司），HH-8 数显恒温水浴锅（江苏科析仪器有限公司），722s 光度计（上海精密科学仪器有限公司），实时荧光定量PCR 仪（美国Stratagene 公司），低温高速离心机（德国贺利氏公司），光学显微照相系统（日本奥林巴斯公司），生物显微镜（日本尼康公司）等。

2 实验方法

2.1 造模与分组给药 选用C57BL/6Cnc 小鼠作为空白组给予普通饲料喂养；ApoE-/-小鼠分为5 组，即模型组给予高脂饲料喂养；散结通脉方低、中、高剂量组给予高脂饲料喂养，造模成功后中药低、中、高剂量分别灌胃4 周；阿托伐他汀钙片组给予高脂饲料喂养，造模成功后阿托伐他汀钙片灌胃4 周。

其中散结通脉方按照人和动物间体表面积，计算小鼠等效剂量每天生药量约为17.0 g/kg，并按照0.5:1:2的比例设置3 个给药剂量。阿托伐他汀钙片的小鼠临床等效剂量约为0.002 6 mg/（g·d）。均釆用灌胃途径给药，每天1 次灌胃，连续干预4 周后取材。

2.2 取材 末次灌胃给药后，小鼠禁食不禁水12 h，采用摘除眼球法取血，然后颈椎脱位处死。取部分主动脉组织置于多聚甲醛中固定，其他置于冻存管中，-80 ℃保存备用。

2.3 指标检测

2.3.1 血脂检测 采用日立全自动生化分析仪检测总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白含量（HDL-C）。

2.3.2 主动脉病理组织HE 染色 取出多聚甲醛中的标本，经酒精逐级脱水、透明处理后包埋成块，切片约3 μm；用苏木素染色约3 min；伊红染色约3 min；再次常规脱水、透明处理后封片。最后在显微镜观察组织切片并拍照。

2.3.3 免疫组化法检测ABCA1、ABCG1、SR-A1、CD36蛋白表达 首先将石蜡组织以3 μm的厚度切片，脱蜡水化；避光滴加3%H2O2于切片上封闭；将玻片置于3%BSA 中孵育后，根据抗体试剂盒说明书，滴加一抗，湿盒中孵育过夜；然后滴加二抗，常温孵育；DAB 显色，避光孵育；最后苏木素复染，透明处理，并滴加中性树脂进行封片。最后在显微镜下观察并拍照。

2.3.4 Real-time PCR 检测ABCA1、ABCG1、SR-A1、CD36 mRNA 表达 首先利用Trizol 法提取动脉组织总RNA；根据逆转录试剂盒制备cDNA；然后配置PCR反应体系。PCR 引物由invitrogen 公司合成，见表1。PCR 扩增的反应条件为cRNA，94 ℃30 s；94 ℃15 s；60 ℃15 s；72 ℃30 s。以上过程各重复40 个循环。最后应用2-△△Ct方法分析mRNA 的相对表达。

表1 引物序列

2.4 统计学处理 实验数据采用SPSS 17.0 软件进行分析，分析结果采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差（One-way ANOVA）分析。

3 实验结果

3.1 散结通脉方改善ApoE-/-小鼠血脂的作用 与空白组比较，模型组中TC、TG、LDL-C的水平明显升高（P＜0.01），HDL-C 水平明显下降（P＜0.01）。与模型组比较，散结通脉高剂量组和阿托伐他汀组中TC、TG、LDL-C 的水平明显下降（P＜0.05，P＜0.01），HDL-C 水平明显升高（P＜0.01）；中药中剂量组中TC、LDL-C 的水平下降（P＜0.05），HDL-C 水平升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠血清血脂水平比较（± s） mmol/L

表2 各组小鼠血清血脂水平比较（± s） mmol/L

注：与空白组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.2 各组小鼠主动脉病理组织变化 在空白组中主动脉无斑块病理改变，血管内、中、外膜三层结构完整；未见内膜增厚，中膜肌层排列有序。模型组中主动脉可见明显斑块病理改变，内膜明显增厚，有巨噬细胞、泡沫细胞及炎性细胞浸润等，中膜平滑肌细胞排列紊乱，弹力纤维板成波浪状，板间间隙增大。散结通脉方不同剂量组呈现不同程度改善，其中低、中剂量组中斑块减少，仍有内膜不光滑，见少量巨噬细胞、泡沫细胞及炎性细胞等。高剂量组和阿托伐他汀组中动脉病变显著减轻，内膜轻度增厚，且不光滑。可见散结通脉方可以改善ApoE-/-小鼠主动脉斑块病理变化。

3.3 各组主动脉病理组织中ABCA1、ABCG1、CD36、SR-A1 的表达 与空白组 比较，模型组ABCA1、ABCG1 蛋白表达下降（P＜0.01），CD36、SR-A1 蛋白表达升高（P＜0.01）。与模型组比较，散结通脉高剂量组和阿托伐他汀组中ABCA1、ABCG1 蛋白显著上调（P＜0.05，P＜0.01），中剂量ABCG1 蛋白上调有统计学差异（P＜0.05），中剂量ABCA1 及低剂量ABCA1、ABCG1 蛋白有上调趋势，但无统计学意义（P＞0.05）；中、高剂量组和阿托伐他汀组中CD36、SR-A1 蛋白显著降低（P＜0.05，P＜0.01），低剂量CD36、SR-A1 蛋白有下降趋势，但无统计学差异（P＞0.05）。见图2，表3。

表3 各组小鼠主动脉切片CD36 蛋白免疫组化结果（± s）

表3 各组小鼠主动脉切片CD36 蛋白免疫组化结果（± s）

注：与空白组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

图1 小鼠主动脉HE 染色（100×）

图2 各组小鼠主动脉病理组织中ABCA1、ABCG1、CD36、SR-A1 蛋白免疫组化结果（200×）

3.4 RT-PCR 法观察主动脉病理组织中ABCA1、ABCG1、CD36、SR-A1mRNA表达水平的影响 见表4。

表4 各组主动脉病理组织中mRNA 表达水平比较（± s）

表4 各组主动脉病理组织中mRNA 表达水平比较（± s）

注：与空白组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

4 讨论

动脉粥样硬化是动脉管壁的一种慢性疾病，而脂质沉积和炎症在斑块的发病机制中起着核心作用。早在19 世纪，Nicolai Anitschkow 提出“无胆固醇无动脉粥样硬化”。动脉粥样硬化发生发展主要是由LDL-C进入损伤的血管内膜开始，形成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），被进入内膜的巨噬细胞不断摄取形成泡沫细胞，泡沫细胞最终坏死崩解后导致脂质和复合糖类等的积聚，逐渐演变成脂滴、脂质纹及脂质核等，触发及加重动脉硬化病变。多项研究还发现，胆固醇积聚可以激活炎症、诱导氧化应激、增加内皮损伤等促进动脉粥样硬化[11-13]。因此，调节脂质代谢是防治动脉粥样硬化病程进展中重要的环节。

在本研究中，模型组小鼠血清血脂明显失调，主动脉病理组织HE 染色显示脂质斑块聚集明显。在给予不同剂量散结通脉方和阿托伐他汀组后，小鼠血清中TC、TG、LDL 水平呈浓度依赖型降低，且高剂量组下降最显著，优于阿托伐他汀组；HDL 呈浓度依赖型升高，高剂量组显著升高。主动脉病理组织HE 染色结果显示，不同剂量散结通脉组和阿托伐他汀组能明显改善斑块大小，以高剂量组最佳。由此可见，散结通脉方可有效调节血脂水平及改善动脉粥样硬化病变。

在动脉粥样硬化病程中，脂质的代谢包括胆固醇的摄取和流出等，主要受胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）途径和清道夫受体（scavenger receptors，SRs）的调节。RCT 作为积聚的胆固醇从血管壁运输到肝脏排泄的主要途径，是抗动脉硬化的重要机制之一[14]。胆固醇流出是RCT 途径最关键的一步，主要通过ATP 结合盒转运体A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）和ATP结合盒转运体G1（ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1）等将积累的胆固醇从血管壁内膜下的细胞中转移至高密度脂蛋白（high density lipoproteins，HDL）或载脂蛋 白a-I（apolipoprotein A-I，apoA-I）[14]。ABCA1 和ABCG1 是ABC 转运蛋白超家族的成员。其中ABCA1是一种全尺寸的ABC 转运体，参与RCT 初始阶段，通过介导细胞内胆固醇和磷脂酰胆碱外流到细胞表面的apoA-I，产生新生高密度脂蛋白（preβ-HDL），对血液中HDL 的生物合成至关重要[15]。研究发现，ABCA1通过与apoA-I结合，增加抗炎细胞因子的产生，减少促炎介质的释放，改善动脉硬化病变[16]。ABCG1是一种半型ABC 转运体，只有一个核苷酸结合域和一个跨膜域，并形成一个同源二聚体发挥功能。ABCG1主要介导胆固醇和磷脂酰胆碱等外流到血液或淋巴中HDL 颗粒，同时将胆固醇从外周细胞转移到肝脏进行胆汁排泄，从而防治动脉粥样硬化性血管疾病。研究发现，敲除巨噬细胞ABCG1 后，不仅促进细胞内氧化固醇的堆积，还加速了细胞的凋亡，促进动脉硬化[17]。综上可知，提高血浆或组织中ABCA1 和ABCG1 表达水平，继而发挥抗动脉硬化作用十分重要。在本研究中，模型组小鼠动脉病理组织中ABCA1 和ABCG1 蛋白表达量显著降低。在给予散结通脉方后，可有效提高动脉硬化小鼠主动脉组织中ABCA1、ABCG1 蛋白水平，以高剂量组药效最佳。

研究发现，清道夫受体分化簇36（cluster of differentiation 36，CD36）和A1 类清道夫受体（class A1 scavenger receptor，SR-A1）作为动脉粥样硬化病程中胆固醇摄取的主要贡献者[18]，通过巨噬细胞不受限制的吸收氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL），导致脂质不断积累并形成泡沫细胞，从而促进动脉粥样硬化。而在缺乏或抑制任何一种受体的小鼠中显示出动脉粥样硬化病变的减少[19-20]。有研究指出，CD36 介导的天然LDL 内吞促进泡沫细胞的形成，是早期动脉斑块形成的关键机制[14]。除此以外，CD36 可以通过与多种配体结合，参与巨噬细胞炎症反应、血小板激活和聚集等途径促进动脉斑块[21]。在ApoE 小鼠中，SR-A1 表达降低可以减少ox-LDL 的摄取，抑制泡沫细胞的生成和动脉斑块的发展[22]。此外，SR-A1 还可以介导先天免疫[23]、血管内皮功能[24]等。因此，SR-A1 可能受到多种调节剂的影响动脉斑块相关疾病。在本研究中，模型组小鼠动脉病理组织中CD36 和SR-A1 蛋白表达量显著升高，给予各剂量散结通脉方后，可有效降低CD36、SR-A1 蛋白水平，促进脂质的代谢，改善动脉硬化斑块的病理变化。以高剂量组药效最佳。

综上所述，散结通脉方可通过促进ABCA1、ABCG1表达及降低CD36、SR-A1表达，改善血脂水平，抑制动脉斑块病程进展。因此，散结通脉方调节脂质代谢，即促进胆固醇外流及抑制胆固醇蓄积，可能是散结通脉方抗动脉粥样硬化的作用机制之一。