Ca2+依赖的膜结合蛋白7 在胃癌中的表达及临床意义*

夏天红 曹小萌 袁绍斌 杨斌 段瑞雪 陈德合 郭长安 汪文杰 刘宏斌

胃癌是最常见的消化系统肿瘤，在全球癌症死亡原因居第3 位，2018 年新发病例超过100 万例，死亡近80 万例[1]。尽管在早期诊断和治疗方面取得了进展，但晚期胃癌患者的5 年生存率仍不足5%[2]。

CPNEs（Copines）家族是一种依赖Ca2+的膜结合蛋白，该蛋白在N 端含有两个C2 结构域，在C 端含有一个A 结构域。A 结构域介导整合素和细胞外配体之间的相互作用，其主要功能是结合蛋白质。C2 结构域的关键作用是调控钙和磷脂的结合[3]。Copines 蛋白以钙依赖的方式结合磷脂双分子层的能力表明其可能在膜运输中发挥关键作用[4]。CPNEs 家族由9 个成员组成（CPNE1-CPNE9）。尽管其具体分子生物学功能仍然未知，但研究表明，CPNEs 可能参与了肿瘤发生和发展的多种信号传导途径[3]。例如，在肺癌中过表达CPNE1 通过EGFR 信号通路促进肺癌细胞的增殖和转移[5]。在脑胶质母细胞瘤中[6]敲减CPNE3 的表达后可以通过抑制FAK 信号通路降低GBM 细胞的迁移、侵袭和增殖能力。同样，在食管鳞状细胞癌中发现CPNE5 高表达水平是总生存期的独立预后因素[7]。研究发现，Copine8（CPNE8）的敲减可抑制卵巢透明细胞癌的增殖[8]。国内外关于CPNE7在肿瘤中的研究鲜有报道。本研究通过生物信息学分析，结合实验验证CPNE7 在胃癌中的表达，分析CPNE7 在胃癌中的临床病理意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 基于生物信息学分析CPNE7 在肿瘤中的表达及其与预后的关系 基于肿瘤免疫浸润在线数据库（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）网站，分析CPNE7mRNA 在各种泛癌及其对应的正常组织中的表达差异；从癌症基因组图谱（TCGA）数据中下载胃癌患者的基因表达数据（包括32 个正常组织和375 个肿瘤组织，工作流程类型为：HTSeq-FPKM），分析比较非配对的375 例胃癌患者和32 例正常组织以及配对的27 对肿瘤和癌旁组织中CPNE7 的差异表达。利用受试者工作曲线（ROC），评判CPNE7 的诊断效能。通过Kaplan–Meier plotter database（www.kmplot.com/analysis/）在线数据库评估CPNE7 基因表达与生存预后之间的关系。

1.1.2 病例资料 回顾性收集兰州大学附属第二医院行手术治疗且术后病理学证实为胃腺癌的107 例患者的癌组织和癌旁对照组织来构建组织微阵列（TMA）。纳入标准：1）术前患者行胃镜+活检确诊胃癌并满足手术指征；2）术前未行放化疗及其他任何抗肿瘤治疗；3）术后病理学检查证实为胃腺癌患者。排除标准：1）既往患者有肿瘤病史或并发其他恶性肿瘤；2）术前行新辅助放化疗等抗肿瘤治疗。收集患者临床病理资料，去除组织芯片不完整的病例，共102 例患者纳入本研究。本研究通过医院医学伦理委员会审批（2021A-561）。

1.1.3 胃癌细胞系 本实验所用胃癌细胞系（GES-1、MKN-45、AGS、HGC-27）均购自中国科学院上海细胞库。

1.1.4 实验试剂 兔抗人CPNE7 多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。鼠抗GAPDH 单克隆抗体购自英国Abcam 抗体公司。PCR 引物购自北京擎科生物科技有限公司。CPNE7 F：CTTCACGGTGG ACTACTACTTC，CPNR7 R：AGACACTCTCATCAC GACTTG 购自北京擎科生物科技有限公司。即用型免疫组化SP 试剂盒购自中国福州迈新生物技术开发有限公司。EDTA 组织抗原修复液购自中国福州迈新生物技术开发有限公司。PBS 缓冲液购自北京索莱宝股份有限公司。DAB 显色试剂盒购自中国福州迈新生物技术开发有限公司。抗体稀释液购自中国福州迈新生物技术开发有限公司。TRIzol RNA 提取试剂购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。反转录合成试剂盒购自北京宝日医生物技术有限公司。荧光定量检测试剂盒购自北京宝日医生物技术有限公司。BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝有限公司。SDSPAGE 聚丙烯酰胺凝胶制备试剂盒购自北京索莱宝有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TMA 的构建和免疫组织化学 对于TMA 的构建，将包埋的标本进行5 μm 的连续切片，然后进行H&E 染色。在显微镜下观察定位癌组织和癌旁组织。同时在玻璃片上标记出有代表性的区域。对于每个样本，用1.5 mm 的针头从石蜡包埋的组织块中提取有代表性的肿瘤组织和邻近的正常组织。为生成受体组织微阵列（TMA），将提取的癌和癌旁组织转移到空白的受体石蜡块上。将构建的组织芯片连续切片，然后放置于烤箱中90℃烘片15 min，依次进行二甲苯脱蜡和梯度乙醇脱水后用磷酸盐缓冲液（PBS）浸洗3 次，每次5 min；在EDTA 抗原修复缓冲液中进行抗原修复，PBS 震荡清洗3 次，每次3 min；滴加试剂A（内源性过氧化物酶），37℃温箱中孵育15 min，PBS 震荡洗涤3 次，每次3 min；滴加试剂B（非特异性阻断剂），然后放入37℃温箱中孵育15 min；以1∶400 的浓度滴加CPNE7 抗体（北京博奥森生物技术有限公司），将组织芯片置于湿盒内4℃孵育过夜12 h；取出后在室温下静置 30 min，PBS 缓冲液中震荡洗涤3 次，每次3 min；滴加足量试剂 C（生物素标记的聚合物），37℃温箱中孵育15 min，PBS 缓冲液中震荡洗涤3 次，每3 min；滴加足量试剂 D（链霉菌抗生物素蛋白），37℃温箱中孵育15 min，PBS 震荡洗涤3 次，每次3 min；按照标准方案，采用氨基苯甲酸盐（DAB）显色剂显色；苏木素复染细胞核3 min，蒸馏水冲洗1 min；1%盐酸酒精分化5 s，蒸馏水冲洗1 min；氨水中返蓝1 min，蒸馏水冲洗1 min；最后，依次进行梯度乙醇脱水吹干后二甲苯透明，用中性树胶和盖玻片封片；由两位独立病理学医师对肿瘤中的CPNE7 染色进行盲法评估，结合免疫反应性阳性面积评分及染色强度评分，计算出半定量的免疫反应分数。

免疫染色强度评分：0 分：阴性；1 分：弱；2 分：中等；3 分：强。免疫反应阳性面积评分：CPNE7 阳性表达主要定位于胃癌细胞膜，呈棕黄/棕褐色，1 分：未发现免疫反应细胞；2 分：26%～50%的免疫反应细胞阳性；3 分：51%～75%的免疫反应细胞阳性；4 分：76%～100%的免疫反应细胞阳性。CPNE7 免疫组织化学评分=免疫染色强度分数×免疫反应阳性面积评分。最终表达评分范围为0～12 分，得分≥6 分的组被归为高表达组，得分<6 分的组被归为低表达组[9]。

1.2.2 RT-PCR 检测CPNE7mRNA 的表达 胃癌细胞HGC-27、MKN45、AGS 以及人正常胃黏膜上皮细胞GES-1 培养于含有10%胎牛血清的RPMI 1 640培养基中。培养条件37℃，5%CO2。采用Trizol 总RNA 分离试剂从培养的细胞中提取总RNA。采用Takara 反转录试剂盒将总RNA 反转录成cDNA。用SYBR Green 进行实时定量PCR。采用Applied Biosystems®7 500 Real-Time PCR 系统（赛默飞世尔科技中国有限公司）收集数据。比较目的基因与GAPDH 的相对表达水平，采用2-ΔΔCt方法计算了表达的倍数变化。

1.2.3 Western blot 检测CPNE7 蛋白的表达 将生长约90%融合度的细胞用预冷的PBS 清洗3 次，加入RIPA：PMSF=100∶1 的细胞裂解液裂解细胞40 min，4℃ 12 000 rpm 离心15 min，收集上清液后用BCA 定量检测蛋白浓度。采用SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶对细胞总蛋白进行电泳（80 V 电泳30 min后120 V 电泳60 min），后转移到PVDF 膜上（180 mA/90 min），用5%的脱脂牛奶封闭2 h；孵育CPNE7 抗体（1∶1 000）和GAPDH 抗体（1∶5 000）4℃过夜12 h；1XTBST 洗膜3 次，每次10 min；室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000）60 min；1XTBST 洗膜3 次，每次10 min；采用BIO-RAD 凝胶成像系统曝光显影；用Image J 软件分析印迹图像，并以GAPDH 作为内参计算综合密度值。

1.3 统计学分析

采用 SPSS 22.0 软件和 GraphPad Prism 8.0 处理实验数据。用χ2检验、Fisher 概率法或 Wilcoxon 秩和检验分析CPNE7 表达与患者的临床病理特征之间的关系；研究变量之间的双变量相关性采用Spearman等级相关系数；三组之间的比较采用单因素方差分析。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 数据库中CPNE7 的表达及与预后的关系

基于TIMER 数据库，对CPNE7mRNA 表达水平进行泛癌分析。结果显示，CPNE7mRNA 表达水平在多种癌症中表达水平显著高于正常组织（P<0.05，图1）。对TCGA 数据库中的胃癌数据进行分析，结果显示CPNE7 在375 例胃癌和32 例正常组织（图2A）以及配对的27 对胃癌和癌旁组织（图2B）中的表达水平显著高于正常组织（P<0.001）。CPNE7 的ROC 曲线提示其诊断效能为AUC=0.727（95%CI：0.687～0.768，图2C）。基于KM-Plotter 数据库评估CPNE7 的表达与胃癌患者总体生存率之间的关系，结果显示在高表达CPNE7 的GC 患者中其总体生存率低于低表达水平的患者（HR=1.72，图3）。

图1 CPNE7 在泛癌中的表达

图2 TCGA 数据库中CPNE7 的表达及ROC 曲线

图3 KM-Plotter 数据库中CPNE7 表达与总体预后的关系

2.2 CPNE7 在组织芯中的表达

对免疫组织化学结果进行分析显示，CPNE7 蛋白主要定位于GC 的细胞膜；CPNE7 在胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁对照组织，胃癌组织中CPNE7 阳性率为85.3%（87 例），癌旁对照组织为35.3%（36 例），差异具有统计学意义（χ2=53.257，P<0.01）（图4）。

图4 免疫组织化学检测组织芯片中CPNE7 的表达（SP×200）

2.3 CPNE7 在胃癌患者组织芯片中的表达与临床病理参数相关

为探究胃癌患者癌组织中CPNE7 的表达与患者临床病理参数之间的关系，收集胃癌患者的各项临床病理参数；Cox 回归分析T3、T4 分期CPNE7 表达与胃癌患者总体生存率之间的关系，结果显示在高表达CPNE7 的胃癌患者中其总体生存率低于低表达水平的患者（HR=2.09，图5），验证了基于数据库的结果。单因素χ2检验分析CPNE7 的表达与胃癌临床病理特征之间的关系（表1），结果显示CPNE7 的高表达与临床分期（P<0.001）、T 分期（P=0.012）、N 分类（P=0.01）、淋巴结浸润（P=0.005) 和Lauren's 分型相关（P=0.007)。然而，CPNE7 的表达与年龄（P=0.377）、性别（P=0.121）、远处转移（P=0.835）、肿瘤的位置（P=0.389）、血管浸润（P=0.275）、神经浸润（P=0.814）、病理分化（P=0.15）无相关。Spearman 分析CPNE7 的表达与临床病理特征的相关性，结果显示CPNE7 的表达与临床分期（P<0.001）、T 分期（P<0.001）、N 分期（P<0.001）、淋巴结浸润（P=0.008）、Lauren's 分型（P=0.032）相关（表2）。

表1 胃癌组织中CPNE7 的表达与临床病理特征的关系

表2 Spearman 分析CPNE7 的表达与临床病理特征的相关性

图5 T3、T4 分期CPNE7 表达的生存曲线

2.4 CPNE7 在胃癌细胞中的表达

为了进一步验证数据库和基于TMA 的CPNE7的表达水平，本研究使用rt-PCR 和Western blot 检测胃癌细胞株（MKN-45、AGS、HGC-27）和胃黏膜正常上皮细胞（GES-1）中CPNE7mRNA 和蛋白的表达水平，结果显示胃癌细胞株HGC-27、AGS、MKN-45中CPNE7 蛋白的表达水平高于胃黏膜正常上皮细胞（图6A）；胃癌细胞中CPNE7mRNA 的表达水平明显高于正常胃黏膜上皮细胞（图6B）。

图6 CPNE7 在胃癌细胞株及胃黏膜正常上皮细胞中的表达

3 讨论

胃癌是常见消化系统肿瘤，大多数胃癌患者就诊时已表现为晚期病症，生存率极低[10]。因此，探究胃癌有效的分子诊断标志物是开发靶向治疗以及评估胃癌患者风险分层的首要任务。

有研究表明，CPNE 家族不仅在神经系统的发育和分化中起着重要作用，而且在多种肿瘤的发生和发展中起着重要作用。如CPNE1 的表达在前列腺癌患者中明显增加，CPNE1 的表达与前列腺癌患者的临床分期、格里森评分和预后相关[11]。结直肠癌外泌体中CPNE3 高表达的患者其无病生存率和总生存期明显下降，表明CPNE3 有可能作为一种诊断和预后的分子标志物[12]。另有研究表明，高表达CPNE5 的多发性骨髓瘤患者有更长的总生存期和无事件生存期[13]，CPNE5 可能作为多发性骨髓瘤患者的一个重要诊断指标。Zhao 等[14]研究发现长链非编码RNA RP11-396F22.1 可作为早期宫颈癌诊断的生物标志物，其被敲除后CPNE8 的表达明显增加，提示CPNE8 与宫颈癌之间可能存在关系，但其阐明其具体机制需要更多的研究。此外，有研究发现CPNE7 在间充质干细胞中的上调通过激活NF-κB 信号通路促进口腔磷状细胞癌的增殖、侵袭和转移[15]。上述研究表明，CPNE 家族成员可能是癌症诊断的潜在分子标志物。CPNE7与CPNE1、CPNE3 高度同源，且具有相同的生物学结构，其在消化系统肿瘤中的研究鲜有报道，本研究利用生物信息学分析结合组织芯片验证发现，CPNE7 在胃癌组织中呈高表达，且高表达CPNE7 的胃癌患者总体预后更差。CPNE7 诊断胃癌的效能较高(AUC=0.727，95%CI：0.687～0.768）。CPNE7 高表达与胃癌患者临床分期、T 分期、N 分期、淋巴结浸润、Lauren's分型相关。组织芯片验证CPNE7 在胃癌组织中的表达水平后，采用RT-PCR 和Western blot 进一步验证CPNE7 在胃癌细胞系中mRNA 和蛋白的表达，结果表明CPNE7 在胃癌细胞系中mRNA 和蛋白的表达水平高于人正常胃黏膜细胞。

综上所述，CPNE7 在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达水平明显升高，且高表达CPNE7 的患者与临床分期、T 分期、N 分期、淋巴结浸润和Lauren's 分型相关，推测CPNE7 可能参与胃癌的发生、发展过程。本研究也存在局限性：对于TMA 的构建其样本量较小且来自单中心，缺乏CPNE7 对胃癌细胞恶性生物学功能的研究。因此，亟需进一步通过细胞功能实验验证CPNE7 对胃癌细胞生物学功能的影响。

本文无影响其科学性与可信度的利益冲突。