比利时杜鹃与爆杖花杂交亲和性研究

尹杨萍 关文灵 宋 杰 李叶芳 杜 娟

（1. 云南农业大学园林园艺学院，云南 昆明 650201；2. 云南省农业科学院花卉研究所，云南 昆明 650201）

比利时杜鹃（Rhododendron hybridum）又名西洋杜鹃，属于杜鹃花科（Ericaceae）杜鹃花属（Rhododendron）常绿灌木。因其株型矮壮、花大且花期长，受到了销售市场的喜爱。但比利时杜鹃存在严重的退化现象，其适应性及抗病抗虫能力较差[1]，在栽培后期易出现观赏性不佳的情况。常绿灌木野生杜鹃爆杖花（Rhododendron spinuliferum）为杜鹃花属，糙叶杜鹃亚属（Subgen.Pseudorhodorastrum）植物，花色朱红或橙红，花形筒状，观赏性佳，具有作为杂交亲本的潜能。

我国杜鹃花种质创新技术已较为成熟，但育种进程缓慢，对野生杜鹃资源的开发和利用还不足，在种质创新研究中应加大对我国丰富野生杜鹃资源的利用[2]。当前育种途径还是以传统杂交育种为主，通常采用远缘杂交育种方法打破生殖隔离来培育观赏性强、抗性高的新品种杜鹃。通过杂交亲和性来判断远缘杂交是否成功，一般包括以下几个指标：子房膨大情况、坐果率、单果种子数、授粉后花粉在柱头的萌发情况、花粉管伸长及受精情况[3]。在前人研究中常绿杜鹃组亚组间杂交可达到高育性[4]，然而总体上杜鹃花种间杂交还是存在严重的受精前障碍，野生杜鹃存在杂交子房膨大率低的情况，不同亚属间的杜鹃杂交后还存在严重受精前障碍[5]。杂交受精前障碍存在的现象一般包括：柱头上花粉大量萌发，但会分泌出胼胝质来阻止花粉管伸入花柱，即使进入花柱后，花粉管也可能发生扭曲变形、顶端膨大和停止生长等现象，或者是花粉管过度生长等[6-7]。在目前的报道中有多种克服远缘杂交受精前障碍的有效方法，其中一种是利用不同授粉方式进行杂交授粉，能够打破杂交障碍，成功获得杂种后代。国内外育种研究者发明了多种能够有效克服远缘杂交受精前障碍的授粉方式，如延迟授粉[8]、重复授粉[9]、切割柱头授粉[10]等，Lee 等[11]的研究表明，正己烷处理和蒙导授粉是克服杜鹃花受精前障碍有效办法。本研究对不同亚属间的比利时杜鹃‘西玛’和野生杜鹃爆杖花的杂交亲和性进行综合评价，并探讨不同授粉方式对克服杜鹃杂交障碍的效应，研究成果有助于比利时杜鹃的遗传改良，以培育出适应性更强，观赏性更优的新品种杜鹃。

1 材料与方法

1.1 材料

母本为园艺品种比利时杜鹃‘西玛’，栽植于云南农业大学园林园艺学院苗圃，植株生长健康，可正常开花。父本野生杜鹃爆杖花花粉采自云南省昆明市大哨村。

1.2 杂交前准备

在‘西玛’和爆杖花盛花期时分别进行花柱长度的测量，得出父/母本花柱长度比为1.02，根据父/母本花柱长度比越接近1.0 则杂交越容易成功的理论判定此亲本组合可进行杂交[12]。父本爆杖花朵采集后用针将花粉挑出，取部分新鲜花粉以MTT 染色法进行活力测定，得出花粉活力为71.44%，判定其可用于杂交授粉，剩余花粉放入硅胶干燥锅里干燥48 h，后密封贮藏于-20 ℃冰箱里，待母本花期时进行杂交授粉。

1.3 授粉方式

2020 年1—4 月为比利时杜鹃‘西玛’的盛花期，在此期间选取即将开放且已分泌粘液的花苞，去除雄蕊和花冠后即可用不同方式授粉，每日授粉时间为早上08: 00—11: 00，每种授粉方式下授粉50 朵。授粉后观察并统计子房膨大数。待果实由绿转黄后将果实采收并统计坐果数，剥出种子统计单果种子数。

授粉方式有：1）常规授粉：在柱头上直接涂抹花粉；2）切割柱头授粉：切去子房上部的柱头和花柱，在伤口处涂抹花粉培养液（蔗糖50 g/L +H3BO3100 mg/L + Ca(NO3)2·4H2O 300 mg /L）；3）加热花粉法：将花粉40 ℃恒温处理1 h 后，再用于授粉；4）延迟授粉法：在去雄后套袋至第4 天进行授粉；5）重复授粉：以常规授粉方式连续授粉3 d；6）NAA 涂抹法：用0.1% NAA（萘乙酸）溶液涂抹柱头后授粉。

1.4 花粉管的荧光观察

取杂交授粉后8 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d 的花柱及子房观察，每个时段每种授粉方式采集至少3 朵花的雌蕊。雌蕊采取后尽快放入FAA 固定液中固定24 h，保存备用。随后以70%乙醇—50%乙醇—30%乙醇—蒸馏水逐级漂洗3 次。压片前，于60 ℃恒温水浴中浸入8 mol/L NaOH 溶液中处理4 h，蒸馏水冲洗直至不再变色后用苯胺蓝溶液染色24 h 后，雌蕊纵切展开滴加1～2 滴甘油压片，在荧光显微镜下观察，每张片子选取3 个视野拍照记录。

1.5 杂交种子无菌萌发

将收获的杂交种子在0.1%的GA3中浸泡24 h进行预处理，在超净工作台中以2.0%的NaClO灭菌20 min 后接种于1/4 WPM 培养基，放置于组织培养室进行培养观察，30 d 后统计萌发数及绿苗数。

1.6 数据与指标体系等级划分

各项指标计算方法为：

（1）子房膨大率（Or）=子房膨大数/授粉花朵数 × 100% ；（2）坐果率（St）=蒴果数/授粉花朵数 × 100%；（3）杂交种子萌发率（Gr）=萌发种子数/接种种子数 × 100%；（4）杂交种子绿苗率（Gs）=绿苗数/发芽数 × 100%；（5）绿苗系数（Gc）=绿苗率/萌发率；（6）单位可育种子数（Sf）=蒴果平均种子数（Cs） × 绿苗率。

各指标等级划分方法参照文献[13]。1）作为杂交合适度指标，坐果率划分等级：不能坐果为0、0＜低＜20、20≤中＜40、高≥40；2）作为种子生活力指标，绿苗率划分等级：无绿苗为0、0＜低＜10、10≤中＜50、高≥50；3）绿苗系数为阈值0 ～1 的相对化指标，划分等级：无绿苗为0、0＜低＜0.6、0.6≤中＜0.9、高≥0.9；4）作为具有正常生活力种子绝对指标，单位可育种子数划分等级：无能育种子为0、0＜低＜20、20≤中＜200、高≥200。

将上述指标根据实际数据赋予权重并划分等级分值，累计得出综合评分，对杂交可育性进行评价。设总权重（最高分值）为10 分，绿苗率最高5 分，绿苗系数最高2 分，坐果率与单位可育种子数分别最高1.5 分，方案见表1。根据综合评分将可育性划分为4 个等级，即0≤无＜2.5 为不育型；2.5≤低＜5 为弱育型；5≤中＜8 为能育型；高≥8 为高育型。

表1 杂交可育性指标等级与权重分配Table 1 Fertility index grades and weight allocations

2 结果与分析

2.1 不同授粉方式下花粉管的荧光观察

‘西玛’ × 爆杖花杂交组合花粉管生长状况见图1。杂交授粉8 h 后，切割柱头法未见花粉萌发，常规授粉法、NAA 涂抹柱头法、重复授粉法、加热花粉法、延迟授粉法授粉在雌蕊柱头上均观察到花粉的大量萌发。常规授粉2 d 后发现花粉管扭曲，4 d 后花粉管生长近花柱中部，同时发现胼胝质反应，12 d 后仅有少量花粉管到达子房；NAA 涂抹柱头法授粉4 d 后产生胼胝质反应，6 d 后发现花粉管扭曲缠绕，12 d 后大量花粉管生长到达子房；加热花粉法花粉管生长迅速，1 d 后到达花柱1/4 处，4 d 后花粉管出现扭曲，8 d 后接近子房，10 d 后生长进入子房；延迟授粉法2 d 后出现花粉管折叠扭曲，6 d 后发现激烈胼胝质反应，12 d 后生长到达子房；重复授粉法2 d后出现花粉管扭曲，6 d 后少量花粉管生长到达子房。

图1 不同授粉方式杂交后的花粉管荧光观察Fig. 1 Fluorescence observation of pollen tube after hybridization with different pollination methods

2.2 授粉方式对子房膨大率和坐果率的影响

杂交组合‘西玛’ × 爆杖花以不同授粉方式杂交后的子房膨大率及坐果率结果见表2。由表2可知，在常规授粉杂交方式中，‘西玛’ × 爆杖花杂交子房膨大率及坐果率均为0.00%，但是NAA 涂抹柱头法、重复授粉法、加热花粉法、延迟授粉法4 种方式均能有效提高杂交子房膨大率及坐果率，说明这些方法能够有效提高‘西玛’ ×爆杖花的杂交成功率。其中，重复授粉的子房膨大率最高，达到了58.00%，但坐果率只有50.00%，而切割柱头法未见子房膨大，说明此法不适用于本杂交组合。

表2 不同授粉方式对杂交亲和性的影响Table 2 Effects of different pollination methods on cross affinity

2.3 杂交亲和性指标及综合评价

杂交组合‘西玛’ × 爆杖花的杂交亲和性指标包含蒴果平均种子数、萌发率、绿苗率、绿苗系数和单位可育种子数。经测算得出杂交蒴果平均种子数为252.33，杂交种子的萌发率为15.00%，根据育性指标等级与权重分配结果（表1）可知：杂交种子的绿苗率5.00%为低等，得分1.0；绿苗系数0.33 为低等，得分0.5；单位可育种子数12.62 为低等，得分0.5；根据表2 可得常规授粉下坐果率为0.00%，得分0 分。由以上各单项杂交亲和指标进行加合，得出最终杂交可育性综合评分为2.0，综合评价‘西玛’ × 爆杖花杂交组合可育性为不育型。

3 结论与讨论

杜鹃的柱头可授期一般会持续一段时间，在性成熟时会分泌粘液。有学者的研究表明杜鹃的柱头开始分泌粘液时可授性开始变强[14-15]，经过测试比利时杜鹃‘西玛’也有相同的结果，即粘液分泌时柱头有较强的可授性，因此试验在确定授粉时机时以开始分泌粘液为认定标准。杜鹃杂交同时存在受精前障碍和受精后障碍[16]。受精前障碍是花粉不能在柱头上萌发直到子代败育的阶段[13]，障碍表现在花粉管异常膨大、变形甚至是停止生长以至于不能生长到达胚珠[17]，具体表现在授粉后子房不会膨大或无坐果，本试验中花粉管荧光观察发现‘西玛’ × 爆杖花杂交组合出现了包括花粉管扭曲折叠，产生胼胝质反应或是不能生长到达子房等花粉管异常的情况，推测存在受精前障碍。通过不同的授粉方法可以破除杂交障碍提高杂交的成功率，而不同的授粉方式对不同的杂交组合效果不一致，有可能表现为促进坐果率的提升，也有可能表现出坐果率降低的情况，耿兴敏等[18]研究发现以正己烷处理不同的杂交组合，只提高了映山红 × 猴头杜鹃（Rhododendron simsii×R. simiarum）和映山红 × 马缨杜鹃（R. simsii×R. delavayi）的膨大率，其余杂交组织均表现为膨大率降低。本研究中采用的NAA 涂抹柱头法、重复授粉法、花粉加热法、延迟授粉法授粉结果对‘西玛’ × 爆杖花的子房膨大率和坐果率均显示为促进作用。此外，切割柱头法授粉后母本植株上未见坐果，显示杂交失败，通过授粉后花粉管荧光观察的结果发现花粉在柱头切割处并未见萌发，推测可能是切割柱头后涂抹的花粉培养液配方不适用，或是由于切口过小，导致培养液挥发失效。因此，切割柱头法并不适用于所有植物[19]，而切割柱头法也与花柱的粗细，长短以及切割位置等有关[20-21]。受精后障碍表现在胚珠停止发育，种子不能发芽和后代苗白化等情况[22-24]。本试验中存在坐果率低于子房膨大率的情况，说明存在胚珠败育的情况，同时还存在杂交种子萌发率偏低，有白化苗的情况，表明比利时杜鹃‘西玛’与爆杖花杂交还存在受精后障碍。针对受精后障碍，可通过对杂交幼胚进行拯救等方法来破除，耿兴敏等[25]对杜鹃杂交幼胚进行胚拯救，发现不同的杂交组合适宜拯救的胚龄也不同，后期研究可继续探索杜鹃杂交的受精后障碍破除办法，为提高杜鹃杂交成功率并获得更多杂交后代提供参考信息。

杂交亲和性的直接指标是受精过程的完成与否，即胚的形成与否，但是胚的检测存在一定难度，因此有必要取用间接指标来评判杂交的亲和性。单果种子数与受精率有关[26]，受精率越高 则种子数越高，杂交种子中具有潜在生活力的种子会萌发成绿苗，不具有生活力的种子则不会萌发或者小苗呈现黄化、白化或畸形以至于最终无法成活[27]，所以绿苗率也是评判杂交亲和性的一项重要指标。本试验选取了子房膨大率、坐果率、蒴果平均种子数及种子萌发率、绿苗率几项直接指标以及经公式推算得出的绿苗系数及单位可育种子数作为判断亲和性的指标，并划分等级对其中几项与杂交亲和性相关度较大的指标进行分数评定，最终得出杂交可育性综合评分，这种评价方法比单纯根据子房膨大率、坐果率等指标判断亲和性更加科学。本研究根据杂交可育性综合评分判定比利时杜鹃‘西玛’ × 爆杖花杂交组合可育性为不育型。