基于GABA信号通路探究柏子养心汤对失眠大鼠睡眠时相的影响

谭高峰,乔明亮,郭 健,郑伟锋,赵彦青,张希倩

0 引言

1 材料和方法

1.1 动物 124只健康雄性SPF级6～7周龄Sprague Dawley(SD)大鼠,体重(200±20) g,由河南省实验动物中心提供,许可证号：SCXK(豫)2017-0001。所有大鼠在河南省中医院中心实验室饲养,许可证号：SYXK(豫)2021-0018,于12 h光暗循环、温度20～22 ℃和湿度50%～55%的房间中饲养,喂食期间大鼠可自由饮水。本实验经河南省中医院动物伦理委员会审批(批号：HNZYY20210819)。

1.2 主要药品、试剂及仪器 柏子养心汤：柏子仁10 g,远志10 g,酸枣仁20 g,党参20 g,枸杞子15 g,黄芪20 g,当归10 g,白芍10 g,五味子10 g;饮片购自河南省中医院,常规方法煎煮,双层棉纱布进行过滤,收集滤液并文火煎煮浓缩制成2 g生药/ml的水提物,分装后4 ℃冰箱内保存备用。对氯苯丙氨酸(Para-chlorophenylalanine,PCPA)(C6506)购自美国Sigma公司;大鼠GABA检测试剂盒(FS-E6774)购自上海抚生实业有限公司;大鼠Glu检测试剂盒(AKAM002U)购自北京盒子生工科技有限公司;兔源一抗谷氨酸脱羧酶67(Glutamate decarboxylase 67,GAD67)(ab213508)、γ-氨基丁酸A型(γ-aminobutyric acid type A receptor,GABAA)受体α1(GABRA1,ab252430)、GABAA受体β2(GABRB2,ab156000)、GABAA受体γ2(GABRG2,ab288564)均购自英国Abcam公司。71000全自动脑立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);SleepSign动物睡眠生物解析系统(日本KisseiComtec公司);Multiskan GO酶标仪(Thermo Scientific,美国);BX61光学显微镜(日本Olympus公司);ABI Prism 7500型实时荧光定量PCR(RT-qPCR)仪(美国Applied Biosystems公司)。

1.3 主要方法

1.3.1 脑电图(Electroencephalogram,EEG)和肌电图(Electromyogram,EMG)电极埋置 用戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉大鼠并固定在脑立体定位仪中,暴露头骨。参照文献报道的方法[13]将2个螺钉电极(直径1 mm)植入颅骨(AP-2,R2;AP+2,R2)作为皮层电极,另一个置于额骨中心(AP+5,R0)作为皮层电极接地电极。皮层电极必须接触硬脑膜,但不穿破硬脑膜。电极通过引线连接到微型插座上,并用牙科丙烯酸水泥固定在头骨上。将2根采集EMG的电极分别插入两侧颈部斜方肌中[14]。术后,将大鼠放入单独的有机玻璃盒中,并在标准条件下饲养在电磁屏蔽记录室中。每只大鼠腹腔注射45 000 U青霉素3 d预防感染,每天1次。恢复7 d后,测试前,将附有EEG记录导线的插头连接到大鼠头部电极插座5.5 h以适应实验条件。

1.3.2 模型的建立 PCPA混悬液配置：NaHCO3片剂用30～40 ℃的温水溶解,调配成浓度为5%的NaHCO3溶液,在一定量生理盐水中缓慢滴加配置好的NaHCO3溶液,在滴入过程中用pH精密试纸测试,将pH值调至7～8之间。然后加入PCPA,搅拌后加阿拉伯胶,再用超声处理15 min即可。将SD大鼠随机分为对照组(n=24)和造模组(n=100),参考文献方法[15]建立失眠大鼠模型：将PCPA用生理盐水溶解,造模组大鼠于每日上午8至9点以300 mg/kg的剂量腹腔注射PCPA溶液,注射体积为10 ml/kg,每天1次,连续注射2 d。对照组注射等量生理盐水。第2次注射PCPA后12 h,观察造模组大鼠的状态,并将对照组和造模组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液(50 mg/ml)进行戊巴比妥钠翻正实验,记录大鼠睡眠潜伏期和睡眠时间。若大鼠出现躁动不安,昼夜节律紊乱,对外界声、光等刺激敏感性增加,且戊巴比妥钠翻正实验中,与对照组相比,造模组大鼠的睡眠时间缩短、睡眠潜伏期延长(P<0.05),提示造模成功。实验共造模100只大鼠,有96只大鼠成功建立失眠模型。

1.3.3 分组与给药 将96只失眠大鼠随机分为模型组及柏子养心汤低、中、高剂量组,每组24只。柏子养心汤组大鼠分别给予5.625 g/kg、11.25 g/kg、22.5 g/kg的柏子养心汤灌胃,对照组和模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃,每天1次,连续7 d。柏子养心汤剂量换算：根据人和动物的体表面积计算药物的等效剂量(大鼠日剂量约为成人的6.3倍)。成人体重以70 kg计算,柏子养心汤成人每日给药剂量相当于生药125 g,则大鼠每日给药剂量为125 g/70 kg×6.3=11.25 g/kg。因此,设置药物低、中、高剂量为5.625 g/kg、11.25 g/kg、22.5 g/kg。

1.3.4 大鼠一般活动状态 观察各组大鼠的精神状态、毛发光泽和昼夜节律变化以及活动情况,给药结束后称量体重。

1.3.5 大鼠睡眠时相分析 末次给药后2 h,将大鼠置于安静的实验室,连接动物睡眠生物解析系统,从第1天19∶00开始,到次日19∶00结束,连续记录自由活动大鼠的EEG和EMG,分析睡眠觉醒(Wake)时间、非快速眼动(Non-rapid eye movement,NREM)睡眠时间和快速眼动(Rapid eye movement,REM)睡眠时间,观察大鼠睡眠时相变化。睡眠Wake以8 Hz以上α和β波为主,伴有明显的EMG信号;NREM睡眠以0.5～4 Hz δ波为主,EMG信号不明显;REM睡眠以4～8 Hz θ波为主,EMG信号基本没有[14]。根据判定结果,统计夜晚(19∶00～次日7∶00)和白天(次日7∶00～19∶00)大鼠Wake总量和NREM、REM睡眠总量。

1.3.6 酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠下丘脑5-HT、Glu与GABA含量 每组随机选取6只大鼠,取出全脑后分离下丘脑(将大鼠脑组织翻转后可见2个对应的菱形突起,用眼科剪左右各剪2刀,深度约1～2 mm,然后取出即可),滤纸吸干后称重,称重后用PBS研磨(按1∶9的重量体积比)制备10%的组织匀浆,在4 ℃下1 000 g离心15 min。收集上清液,采用ELISA试剂盒检测下丘脑中5-HT、Glu与GABA含量。

1.3.7 免疫组织化学法(IHC)检测大鼠下丘脑GAD67表达 每组随机选取6只大鼠的下丘脑,用4%多聚甲醛固定过夜,经梯度乙醇脱水后,用石蜡包埋并连续切5 μm厚的切片。切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后,用3%过氧化氢处理10 min,微波法进行抗原修复,正常山羊血清封闭20 min。然后将切片与一抗GAD67(1∶100)在4 ℃下孵育过夜,PBS清洗后,滴加二抗在37 ℃下孵育30 min;DAB显色、苏木精复染。最后,二甲苯透明,封片。在光学显微镜下观察GAD67阳性表达(细胞膜和细胞质呈棕黄色染色),每张切片随机选择5个视野,计数每个视野中GAD67阳性表达的平均光密度(Average optical density,AOD)值。

1.3.8 Western blot检测下丘脑GABAA受体亚基(GABRA1、GABRB2和GABRG2)蛋白表达 每组随机选取6只大鼠,断头取脑,分离下丘脑,液氮速冻后,-80 ℃冰箱保存备用。用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液盒提取下丘脑组织中的总蛋白。将等量的总蛋白加到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上,通过电泳分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜用5%脱脂牛奶封闭1 h后,与一抗GABRA1(1∶1 000)、GABRB2(1∶1 000)、GABRG2(1∶1 000)和β-肌动蛋白(β-actin,1∶2 000)在4 ℃下孵育过夜。然后洗涤膜并在室温下与结合辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(1∶5 000稀释)孵育1 h。最后,使用增强型化学发光(ECL)试剂显影,Image J软件分析蛋白条带的灰度值。β-actin用作内参对照。

1.3.9 RT-qPCR检测下丘脑组织中GABAA受体亚基(GABRA1、GABRB2和GABRG2)mRNA表达 每组剩余6只大鼠,取下丘脑组织,Trizol试剂提取总RNA,然后用逆转录试剂盒合成cDNA。使用Green Premix PCR试剂盒在ABI Prism®7500型RT-qPCR仪上将该cDNA用作扩增的靶标。热循环方案：95 ℃ 10 min,然后95 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s和72 ℃ 10 s的50个循环。2-ΔΔCt(Ct为循环阈值)方法计算基因表达,并将靶基因的相对表达量标准化为β-actin。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态和体重变化 对照组大鼠精神状态良好,毛发有光泽,昼夜节律明显,白天活动较少;与对照组相比,模型组大鼠精神状态较差,毛发凌乱枯黄、无光泽,昼夜节律消失,白天活动增多,对外界的反应增强,体重显著降低(P<0.05);与模型组相比,柏子养心汤低、中、高剂量组大鼠精神和活动状态明显改善,毛发有光泽,体重显著升高(P<0.05),且呈剂量依赖性。见表2。

2.2 各组大鼠睡眠时相变化 与对照组相比,模型组Wake总量显著增加,NREM和REM睡眠总量显著降低(P<0.05);与模型组相比,柏子养心汤低、中、高剂量组Wake总量显著减少,NREM和REM睡眠总量显著增加(P<0.05),且呈剂量依赖性。见表3。

表2 各组大鼠体重比较

表3 各组大鼠夜晚和白天Wake、NREM和REM睡眠总量比较

2.3 各组大鼠下丘脑中5-HT、Glu与GABA含量 与对照组相比,模型组大鼠下丘脑中Glu含量和Glu/GABA比值显著升高,5-HT、GABA含量显著降低(P<0.05);与模型组相比,柏子养心汤低、中、高剂量组Glu含量和Glu/GABA比值显著降低,5-HT、GABA含量显著升高(P<0.05),且呈剂量依赖性。见表4。

表4 各组大鼠下丘脑中5-HT、Glu与GABA含量比较

2.4 各组大鼠下丘脑中GAD67表达 与对照组相比,模型组大鼠下丘脑中GAD67阳性表达显著减少(P<0.05);与模型组相比,柏子养心汤低、中、高剂量组GAD67阳性表达显著增加(P<0.05),且呈剂量依赖性。见图1、表5。

图1 各组大鼠下丘脑中GAD67表达(IHC,200×)

表5 各组大鼠下丘脑中GAD67表达比较

2.5 各组大鼠下丘脑中GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白表达 与对照组相比,模型组大鼠下丘脑中GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,柏子养心汤低、中、高剂量组GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白水平显著升高(P<0.05),且呈剂量依赖性。见图2、表6。

图2 各组大鼠下丘脑中GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白表达

表6 各组大鼠下丘脑中GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白水平比较

2.6 各组大鼠下丘脑中GABRA1、GABRB2和GABRG2 mRNA表达 与对照组相比,模型组大鼠下丘脑中GABRA1、GABRB2和GABRG2的mRNA水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,柏子养心汤低、中、高剂量组GABRA1、GABRB2和GABRG2的mRNA水平显著升高(P<0.05),且呈剂量依赖性。见表7。

表7 各组大鼠下丘脑中GABRA1、GABRB2和GABRG2的mRNA水平比较

3 讨论

中医称失眠为“不寐”、“目不瞑”、“不得眠”、“不得卧”,年老体虚,情志失常,饮食不节,劳逸失度等为其常见病因;病位在心,与肝、脾、肾密切相关[16-17]。柏子养心汤被广泛应用于失眠的治疗[6-7]。柏子养心汤为中医经典方剂,由柏子仁、酸枣仁、党参、黄芪、当归、茯苓、远志、五味子等中药组成。方药中柏子仁、酸枣仁为君药,有养心安神之效;党参、黄芪可健脾益气、温补元气、促使阴阳平衡;当归活血补血;茯苓、远志能补心安神;五味子补益心肾、宁心安神;诸药合用共奏补益心肾、调整阴阳、宁心安神的功效,能从根本上调整患者状态,改善睡眠质量。现代药理学研究显示,柏子仁可通过增加GABA水平发挥抗焦虑作用[8];酸枣仁-茯苓-党参水提物能调节小鼠脑内Glu/GABA稳态,改善失眠小鼠的睡眠质量[10];当归的活性成分当归多糖能够升高GABA水平,调节神经递质传导,改善小鼠抑郁行为[11];远志可升高失眠大鼠下丘脑GABA含量,降低Glu含量,调节中枢神经递质水平,从而起到安神益智的功效,提高失眠大鼠的学习记忆能力[9];五味子提取物可通过调控海马组织内GABAARα1、GABAARγ2表达,改善失眠大鼠睡眠和自主活动[12]。基于以上研究,推测柏子养心汤对失眠的改善作用可能与GABA信号通路有关。

为了验证此推测,本研究通过腹腔注射PCPA,成功建立了失眠大鼠模型。PCPA是一种5-HT合成酶抑制剂,能阻滞脑内5-HT的合成,导致睡眠昼夜节律消失,引发失眠。NREM和REM睡眠是睡眠时相中2个重要阶段,这2种类型睡眠的总量决定了睡眠的质量[14]。本研究结果显示,柏子养心汤可通过增加PCPA导致的失眠大鼠5-HT含量、NREM和REM睡眠总量的减少,延长睡眠时间,提高失眠大鼠的睡眠质量,与既往的研究结果一致,表明柏子养心汤具有改善睡眠的作用。

下丘脑为人体多种生物调节节律中枢,通过与不同的大脑区域进行交流,在睡眠-觉醒调节中发挥着核心作用[18]。GABA、Glu在脑内,特别是下丘脑内含量极高,是睡眠调节中不可或缺的重要因素[19]。GABA是哺乳动物大脑中主要的抑制性神经递质,与正常人相比,睡眠障碍患者的脑内GABA浓度显著降低[20]。另一项研究表明,口服GABA 30 min后可达峰浓度,可显著缩短受试者的睡眠潜伏期并增加NREM睡眠时间[21]。Glu是主要的兴奋性神经递质,GABA是Glu在谷氨酸脱羧酶(GAD)作用下脱羧形成的,因此,Glu/GABA的比值可以用来评价神经系统的兴奋或抑制状态。GAD67是GABA的关键合成酶,GAD67蛋白水平的降低可抑制Glu向GABA转化[22]。本研究检测了下丘脑中GABA和Glu的含量,结果显示,PCPA模型大鼠下丘脑内GABA水平降低,Glu/GABA比值升高,表明神经系统处于兴奋状态,而柏子养心汤可以显著逆转上述变化。此外,IHC结果表明,PCPA大鼠下丘脑内GAD67的表达量较正常大鼠减少,柏子养心汤可上调GAD67的表达,表明柏子养心汤可促进下丘脑内Glu向GABA转化。提示柏子养心汤可上调GAD67表达,促进Glu/GABA稳态平衡的恢复,从而改善失眠。

GABA通过GABA受体起作用[23]。大脑中的下丘脑含有大量的GABA受体。GABA受体有3种类型：GABAA、GABAB和GABAC。就睡眠而言,最重要的受体是GABAA受体。当GABA或其他激动剂与GABAA受体结合时,会触发氯离子流入神经元细胞,导致抑制动作电位放电的负膜电位,因此,GABA通过激活GABAA受体降低脑细胞的活性[4]。GABAA受体共有19种亚基,以有限的组合组装为功能性受体。大脑中主要的功能性GABAA受体多由α、β、γ亚基组成,其中2个α1亚基、2个β2亚基和1个γ2亚基构成的五聚体是最常见的GABAA受体亚型[24-25]。α1亚基的基因是GABRA1,β2亚基的基因是GABRB1,γ2亚基的基因是GABRG2。在本研究中,PCPA模型大鼠下丘脑中GABRA1、GABRB1、GABRG2的mRNA和蛋白水平均低于正常大鼠,但柏子养心汤能呈剂量依赖性逆转上述变化,表明柏子养心汤可增加PCPA大鼠下丘脑GABAA受体亚基(GABRA1、GABRB1、GABRG2)的表达量,提示柏子养心汤可提高失眠大鼠GABAA受体亚基的表达。

综上所述,柏子养心汤可增加失眠大鼠NREM和REM睡眠总量,延长睡眠时间,改善睡眠质量,其作用机制可能与促进GABA的合成,提高GABAA受体α1、β2和γ2亚基的表达有关。本研究初步探索了柏子养心汤改善失眠的作用及潜在的分子机制,为其应用提供了理论参考。但柏子养心汤对失眠的改善机制尚需进一步的研究验证;此外,除GABAA受体外,GABA也可通过GABAB受体发挥作用,柏子养心汤改善睡眠的分子机制是否与GABAB受体有关,在未来的研究中会进行补充实验加以验证。