基于PD-1/PD-L1通路探讨补肾解毒散结方对晚期结直肠癌患者免疫微环境的影响

张言言,韩 刚,曹 羽,张 云,张 旭,胡 建,龚航军

0 引言

目前,晚期结肠癌主要采用手术、化疗、放疗等综合治疗模式,但疗效并不理想,且复发转移率较高,导致晚期结肠癌的治疗更为棘手[1-2]。近年来,免疫疗法取得巨大进展,肿瘤免疫微环境在肿瘤治疗中发挥重要作用,T淋巴细胞亚群及细胞因子直接影响抗瘤免疫作用及免疫检查点抑制剂的疗效[3-4]。细胞程序性死亡受体1(Programmed death receptor-1,PD-1)/细胞程序性死亡受体-配体1(Programmed death receptor ligand-1,PD-L1)信号通路介导的免疫逃逸与结直肠癌的发生发展密切相关,以PD-1、PD-L1为分子靶点的免疫疗法有望为晚期结直肠癌治疗开辟新的道路[5]。补肾解毒散结方经上海中医药大学附属曙光医院验方,具有补肾解毒、消肿散结之功,在控制结直肠癌术后复发转移方面疗效显著,但其免疫相关机制尚不完全明确[6]。本研究基于PD-1/PD-L1通路,探讨补肾解毒散结方对晚期结直肠癌患者免疫微环境的影响,从而为晚期结直肠癌的临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年1月至2021年12月上海中医药大学附属曙光医院胃肠外科收治的50例晚期结直肠癌患者。入组标准：①参照《中国结直肠癌诊疗规范(2020版)》[7]诊断标准,TNM临床分期为Ⅳ期,且无法手术切除;②年龄≤80岁,预计生存期超过3个月;③近期未接受其他临床研究。其中,男28例,女22例,年龄48～79岁,平均(57.4±6.9)岁;体重指数(Body mass index,BMI)：21.4～23.8 kg/m2,平均(22.5±2.3)kg/m2;病灶部位：升结肠18例,横结肠8例,降结肠7例,乙状结肠7例,直肠10例;分化程度：高分化9例,中分化18例,低分化23例;病理类型：腺癌29例,黏液腺癌9例,其他12例。按照随机数字表法,将所有患者分为研究组和对照组,各25例。两组年龄、性别构成比、病灶部位、BMI、病理类型、分化程度等基本临床特征比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。研究组年龄(56.9±7.6)岁;BMI(22.3±2.1)kg/m2;病灶部位：结肠19例,直肠6例;分化程度：高分化4例,中分化7例,低分化14例;病理类型：腺癌14例,黏液腺癌5例,其他6例。对照组年龄(58.1±6.5)岁;BMI(22.6±2.4)kg/m2;病灶部位：结肠21例,直肠4例;分化程度：高分化5例,中分化11例,低分化9例;病理类型：腺癌15例,黏液腺癌4例,其他6例。本研究符合《赫尔辛基宣言》,经医院伦理学委员会审议通过(批号：2019-1174-111-02),研究方案经患者或监护人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 对照组 对照组给予化疗+PD-1抑制剂,具体方法如下：采用mFOLFOX6方案化疗：奥沙利铂(批号：国药准字H20093892)85 mg/m2静脉滴注,大于2 h,第1天;亚叶酸钙(批号：国药准字H20013091)400 mg/m2静脉滴注,大于2 h,第1天;5-氟尿嘧啶(批号：国药准字H12020959)400 mg/m2静脉推注,第1天;5-氟尿嘧啶1 200 mg/(m2·d)持续静脉泵入48 h,第2、3天。每2周为1个周期,连续12个化疗周期。同时,在mFOLFOX6方案的第4天给予派安普利单抗注射液(批号：国药准字S20210033)200 mg静脉推注,每2周为1个周期,与化疗同步进行。

1.2.2 研究组 在对照组基础上给予补肾解毒散结方内服,药物组成：地黄15 g、女贞子15 g、人参9 g、肉苁蓉12 g、山慈菇15 g、八月札9 g。中药生药均由上海中医药大学附属曙光医院提供并代煎。一贴2袋,每袋200 ml,早晚各温服1袋,连续服用2周。

1.3 观察指标

1.3.1 近期临床疗效 治疗前、治疗4个周期后复查CT或磁共振,应用RECIST评价标准1.1,将临床疗效分为完全缓解(Complete response,CR)、部分缓解(Partial response,PR)、稳定(Stable disease,SD)、进展(Progressive disease,PD)。疾病控制率(Disease control rate,DCR)=(CR+PR+SD)/总例数×100%,客观缓解率(Objective response rate,ORR)=(CR+PR)/总例数×100%。将CR、PR和SD患者纳入有效组,PD患者纳入无效组。

1.3.2 外周血T细胞亚群检测 治疗前、治疗4个周期后,采用Beckman Coulter Cytoflex S流式细胞仪检测外周血T细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)水平,采用HITACHI 7600型全自动生化分析仪检测血清免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)水平。

1.3.3 外周血PD-1、PD-L1水平检测 治疗前、治疗4个周期后,抽取清晨的空腹外周静脉血3 ml,置于EDTA抗凝管中,1 000转/min高速离心20 min,收集上层清液放置在-80 ℃冰箱中保存。将标本样品、标准样品及辣根过氧化物酶标记的抗体加入预包裹抗体的微孔内,孵育并充分清洗。酶联免疫吸附法检测血清PD-1、PD-L1水平,试剂盒购自迪信泰检测科技(北京)有限公司(批号：EKHU3727、EKHU3732),酶标检测仪购自Bio-Rad公司,检测波长450 nm处各孔光密度值(OD450)。

2 结果

2.1 近期临床疗效比较 研究组的DCR为64.0%,明显高于对照组36.0%(P<0.05);两组ORR比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组患者近期临床疗效比较[例(%)]

2.2 治疗前后T细胞亚群比较 治疗前,研究组和对照组CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,研究组CD3+、CD4+水平明显升高(P<0.05),CD8+、CD4+/CD8+较治疗前差异无统计学意义(P>0.05),研究组上述T细胞亚群各指标均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者治疗前后T细胞亚群比较

2.3 治疗前后体液免疫指标比较 治疗前,研究组和对照组血清IgA、IgG、IgM水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);治疗后,两组各体液免疫指标均明显升高(P<0.05),研究组IgA、IgM水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组患者治疗前后体液免疫指标比较

2.4 治疗前后外周血PD-1、PD-L1比较 治疗前,两组外周血PD-1、PD-L1比较,差异均无统计学意义(P>0.05);治疗后,研究组与对照组外周血PD-1、PD-L1水平均显著下降(P<0.05),且研究组明显低于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 治疗前后患者外周血PD-1、PD-L1水平比较(pg/ml)

2.5 研究组不同疗效组患者免疫功能指标及PD-1、PD-L1水平比较 研究组患者中,有效组外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及IgA、IgG、IgM水平明显升高,PD-1、PD-L1水平明显下降(P<0.05)。见表5。

3 讨论

结直肠癌是一种高度异质性的恶性肿瘤,常伴有癌基因、抑癌基因多发性突变[8-9]。研究发现,PD-1/PD-L1信号通路介导的免疫抑制微环境是结直肠癌细胞的生存基础,在肿瘤的发生发展及免疫监视逃逸中发挥重要作用[10-11]。

表5 研究组不同疗效患者免疫功能指标及PD-1、PD-L1水平比较

近年来,随着免疫检查点抑制剂的逐步应用,晚期结直肠癌进入免疫治疗时代[12]。PD-1表达于结直肠癌变组织周围CD8+T淋巴细胞表面,PD-L1异常高表达于癌变细胞表面,二者特异性结合后,可抑制CD8+T淋巴细胞的正常功能,诱导活化的CD8+T细胞凋亡和耗竭,从而介导癌变细胞逃避T淋巴细胞的杀伤。PD-1/PD-L1抑制剂可阻断PD-1与癌变细胞PD-L1结合,重新激活T淋巴细胞杀伤作用,增强免疫应答,识别并杀伤癌变细胞[13-14]。研究证实,PD-1和PD-L1抑制剂能够显著改善部分结直肠癌预后,且联合化疗可能进一步提高治疗效果,但此类研究仍以实验研究为主,临床研究较少,且不良反应发生率较高[15]。

结直肠癌归属于“积聚”、“癥瘕”、“肠癖”等范畴,其病位在肠,病本在肾,为本虚标实之证,脾肾虚弱为本,痰瘀、湿热为标,病机在于正气不足,余毒伏居,湿热蕴结,通降失司,积聚成形[16]。《景岳全书·积聚》记载,凡脾肾不足、虚弱失调之人多有积聚之病。根据上海中医药大学附属曙光医院李琦教授前期研究,补肾解毒散结方具有补肾填精、清热利湿解毒之功,有助于降低肠癌复发转移,改善预后[17]。本方以地黄滋阴补肾为君药,女贞子、肉苁蓉温阳填精为臣药,人参补益元气为佐使,八月札、山慈菇清热解毒、理气散结,全方标本兼顾、攻补兼施,共奏补肾解毒散结之效。本研究结果显示,虽然两组ORR无显著性差异,但研究组的DCR为64.0%,明显高于对照组36.0%,表明补肾解毒散结方有助于进一步改善晚期结直肠癌患者化疗临床疗效。

化疗药物属于攻邪药物,导致脾胃受损、脏腑气血阴阳失调,免疫功能抑制。近年来,PD-1抑制剂联合中药治疗愈发引起重视,中医药作为结直肠癌综合治疗的重要组成,可有效缓解化疗、免疫治疗所致毒副作用,增强免疫力,改善预后。前期实验及临床研究均表明,补肾解毒散结方可抑制结直肠癌侵袭与转移,但具体作用机制尚不明确[18-19]。由于晚期结直肠癌患者获取组织标本不易,本研究通过外周血检测患者治疗前后T淋巴细胞亚群及PD-1/PD-L1表达变化,结果显示,研究组CD8+、CD4+/CD8+较治疗前差异无统计学意义,CD3+、CD4+及IgA、IgG、IgM水平则明显升高,且T细胞亚群各指标及IgA、IgM均优于对照组,与冯媛媛等[20]研究结果相符,同时外周血PD-1和PD-L1水平明显降低,表明补肾解毒散结方有助于调节和提高结直肠癌患者化疗、免疫治疗期间免疫微环境,并抑制PD-1/PD-L1的表达。

对研究组进一步分析发现,有效组外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及IgA、IgG、IgM水平明显升高,PD-1、PD-L1水平明显降低,表明补肾解毒散结方联合化疗、免疫治疗的疗效与PD-1、PD-L1水平密切相关。研究表明,中药可通过调节CD4+、CD8+T细胞及细胞表面的PD-1介导的适应性免疫调节免疫微环境[21]。补肾清毒汤药能够促进成熟树突状细胞(DC)表面分子PD-L2表达,下调表面分子PD-L1表达水平,从而改善DC功能并影响PD-1/PD-L1信号通路[22]。Zhou等[23]研究发现,补肾中药肉苁蓉提取物可上调p53、Bax等抑癌基因表达,通过抑制肿瘤细胞恶性增殖、加速肿瘤细胞凋亡,阻断大肠癌裸鼠移植瘤的生长。

综上所述,补肾解毒散结方可调节晚期结直肠癌患者的免疫微环境,改善临床疗效,其作用机制可能与其通过抑制PD-1/PD-L1信号通路,激活免疫细胞活性,增强机体内源性抗肿瘤免疫效应密切相关,为晚期结直肠癌的临床治疗提供必要的依据。