苦味受体在呼吸系统中应用的研究进展

唐 香,余善君,李 琪,2,3*,周向东,2,3

0 引言

呼吸道作为与外界直接相通的开放性管道,时刻面临着各种吸入颗粒及病原体不同程度的侵袭,因此在抵御病原体入侵方面起着至关重要的防御屏障作用,而化学感觉信号转导通路恰好是呼吸系统细胞感受外界刺激的重要途径。

研究表明,味觉受体不仅存在于舌头的味蕾细胞中,还存在于呼吸、心血管、消化、生殖及中枢神经系统等多个组织器官的化学感觉细胞中,并发挥活性功能。其中呼吸道中苦味受体(Bitter taste receptors,TAS2Rs)及其下游信号转导分子的表达尤为广泛,可参与机体的多种重要生理信号调控[1-6]。本文主要就苦味受体在呼吸系统中的研究进展进行综述。

1 苦味受体

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)是真核生物中规模最大、最具多样化的一类膜受体,可被脂质、糖、肽和蛋白质形式的多种配体激活,将来自外界环境的信息传递到细胞中,以介导其相应的功能反应,如调节嗅觉、味觉和视觉的感官功能,或参与分泌、代谢、神经传递、细胞分化、炎症和免疫反应等多种生理过程[7-8]。味觉作为人类生活中最重要的感觉之一,可以分为甜、苦、鲜、咸和酸5种基本感觉形式。前三者的感觉是通过味蕾细胞中表达的GPCRs来传递,而后两者的感觉是通过激活细胞膜上的离子通道,从而调节味觉受体细胞的功能[9-10]。

表达于呼吸系统中的TAS2Rs是一类感知苦味的七次跨膜的GPCR,2000年Adler教授和Matsunami教授研究组通过对DNA基因组序列数据库进行搜索,发现人类和小鼠在基因遗传图谱上具有相同的苦味感知位点而被命名[11-12]。目前,在人类基因组中已发现25种TAS2Rs基因亚型,各亚型之间大约有30%～70%的氨基酸序列存在相似性,可分别位于5号染色体(5p15)和12号染色体(12p13)的短臂以及7号染色体(7q31)的长臂上,且基因的多样性远丰富于鲜味受体及甜味受体[13-17]。此外,由于自然环境中的苦味物质种类繁多,其结构具有显著差异。研究表明,同一种TAS2Rs具有多个配体结合位点,人类基因组编码的25 种TAS2Rs中,能够识别的配体集合有19种,约占目前已知苦味化合物数据库中的80%,其余孤儿受体的配体集合还有待探索[18-19 ]。相关研究发现,当不同的苦味物质作用于同一种TAS2Rs时,可感知相同的苦味觉,从而引起人体心理或生理上本能的厌恶反应,避免机体对有毒、有害物质的摄取与吸收[20]。因此,某种程度上苦味的感知可被认为是一种抵御有毒物质的关键防御机制。

2 信号转导通路

TAS2Rs的信号转导通路十分复杂,因苦味化合物的化学结构具有多样性,因此其信号传递通路也可能有多种不同形式的转导路径和信号因子参与。其中,苦感产生的大致过程是苦类化合物与味觉细胞顶部微绒毛上的TAS2Rs蛋白结合,然后经细胞内信号转导产生兴奋性信号,传给中枢味觉神经系统而实现[21]。

现有研究表明,肺部TAS2Rs的信号传递级联反应有3种,且彼此之间存在一定的关联[7,9-10,22]。第1种起调节作用,通过G蛋白的α亚基激活磷酸二酯酶(PDE),使得细胞内环磷酸腺苷(cAMP)浓度降低,离子通道抑制作用解除,受体细胞去极化,ATP释放。第2种是通过TAS2Rs同源的G蛋白β和γ亚基活化磷脂酶β2(PLCβ2),导致内质网中的Ca2+释放,激活瞬时受体电位阳离子通道(TRPM5),并通过钙稳态调节剂CALHM1或CALHM1/CALHM3离子通道触发ATP释放起作用。第3种是不需要G蛋白参与的转导级联反应,苦味物质与TAS2Rs直接结合,开放离子通道,产生信号转导。例如,奎宁等苦味配体与TAS2Rs直接结合,开放K+通道,引起K+内流[23](见图1)。

图1 肺部苦味受体的3种信号传递路径

3 TAS2Rs在呼吸系统细胞中的表达

根据组织器官的分布和表达,传统观点认为TAS2Rs仅在味蕾II 型味觉受体细胞中表达。而近年来大量研究表明,TAS2Rs还可在平滑肌细胞、纤毛细胞、簇细胞、免疫细胞及肺癌细胞等多种呼吸系统细胞中表达,并参与调节宿主免疫功能、舒张平滑肌、促进黏液-纤毛清除、抑制微生物感染、改善炎症及气道重塑等一系列病理生理过程[6,24]。

3.1 TAS2Rs在平滑肌细胞中的研究 气道平滑肌(Airway smooth muscle,ASM)是影响气道张力和呼吸生理学的主要细胞类型。有研究发现,激活TAS2Rs能充分打开收缩的气道,引起气道平滑肌松弛和支气管高效舒张,其强度可超过β2 肾上腺素的 3～4 倍,明显高于目前临床上治疗 COPD 和哮喘的最佳药物[25-26],且未发现存在类似β2 肾上腺素能受体脱敏、耐受等问题[27]。Pan等[28]研究表明,以TAS2Rs激动剂氯喹、奎宁及糖精对人ASM细胞进行干预,可显著抑制ASM细胞增殖,并通过靶向阻断磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的信号转导通路,改善炎症引起的气道重塑。即使是在激动剂反复暴露的情况下,TAS2Rs 的表达、信号转导或扩张支气管的功能也不会被影响[27,29]。此外,最近一项突破性的医学研究发现,以TAS2Rs激动剂苦丁皂苷A激活TAS2Rs后,其诱导偶联G蛋白(Gɑt)从TAS2R-Gɑt/Gβγ复合体中解离,然后通过与AChR结合,竞争性抑制AChR的偶联G蛋白Gq功能,从而阻断其下游诱导的钙信号,使预收缩的ASM舒张[30]。该研究首次明确了激活TAS2Rs引起支气管平滑肌扩张的确切作用机制,为治疗COPD和哮喘提供了新的药物靶点。同时也表明了ASM在调节哮喘和COPD等阻塞性气道疾病的病理及生理发展过程中起着十分关键的作用。

除了气道平滑肌细胞,肺血管平滑肌细胞中也表达数种TAS2Rs,具有感知苦味刺激的能力。Manson等[31]从分离的人和啮齿动物肺组织样本中,检测出肺血管平滑肌细胞表达的苦味受体(TAS2R3、TAS2R4、TAS2R10、TAS2R14),后者被多种苦味物质(氯喹、苯甲地那铵、右美沙芬和奎宁等)激活后,能诱导细胞内钙离子增加,使预收缩的血管平滑肌松弛。此外,TAS2R激动剂所诱导的肺血管平滑肌舒张是独立于功能性内皮的,与内皮衍生物的舒张介质(NO或前列环素)无关[31-32]。有研究人员通过体外培养人肺血管内皮细胞(Human pulmonary arterial endothelial cells,HPAECs)模型,发现HPAECs中也存在较为丰富的TAS2Rs,其中TAS2R10和TAS2R38高度表达,可通过cAMP-Rac1信号转导通路,降低LPS诱导的肺内皮通透性和VE-肌钙蛋白的表达,从而改善肺血管内皮屏障功能[33]。这项研究首次证实了人肺动脉内皮细胞中TAS2Rs的存在,对于未来开发降低急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)中血管通透性的治疗靶点至关重要。

3.2 TAS2Rs在呼吸道纤毛细胞中的研究 纤毛细胞是呼吸系统黏液-纤毛清除功能(Mucociliary clearance,MCC)防御作用机制的重要环节,其纤毛节律性的运动能将其所吸附的颗粒、病原微生物等异物通过气道腔面液体层排出呼吸道,从而防止病原体入侵及可能的后续感染[34]。

目前,研究表明人呼吸道纤毛细胞具有可利用味觉受体的化学反应特性[35],其细胞TAS2Rs与呼吸道系统的免疫功能密切相关,是人类呼吸道防御的“哨兵”[36]。当机体受到外界物质(如细菌产物)刺激时,口腔外的味觉受体可作为细菌“传感器”,激活 TAS2R 受体下游的炎症信号,增强黏液清除率、促进抗菌肽分泌和发挥杀菌效应[37]。目前,TAS2R38是较为明确的呼吸道受体亚型,人鼻腔鼻窦黏膜中的单体化学感受细胞(Solitary chemosensory cell,SCCs)和气道纤毛上皮细胞中均有表达[38-39]。体内研究表明,人呼吸道纤毛细胞中的TAS2R38与结合革兰阴性细菌产生的酰基高丝氨酸内酯(Acyl-homoserine lactones,AHLs)信号因子结合后,一方面可依赖激活下游钙依赖性信号转导通路,促进抗菌肽/NO合成与释放,干扰细菌的黏附及细菌生物膜的形成,发挥杀菌效应;另一方面可介导产生的NO激活PKG和cGMP,增加纤毛波动频率,增强呼吸道纤毛清除病原微生物的能力[40-41]。此外,有研究发现,TAS2R38基因位点的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNPs)不仅能影响机体对特定苦味剂感知的能力,还能影响其引起的免疫应答和抗菌效应[42]。在人上呼吸道纤毛上皮细胞中,T2R38 PAV/PAV基因型细胞感知铜绿假单胞菌AHL刺激,释放NO杀灭细菌和增加纤毛清除率的能力明显强于AVI/AVI或PAV/AVI基因型细胞[43];而在慢性鼻窦炎患者中,AVI/AVI基因型患者鼻腔分离细菌形成生物膜的能力则更强[44]。结果表明,TAS2Rs的功能遏制或表达缺陷可能会显著影响呼吸道对病原体的易感性。

3.3 TAS2Rs在簇细胞中的研究 簇细胞是一类较为罕见的化学感觉上皮细胞,可通过细胞膜受体感受外界刺激,释放生物活性物质以调节机体免疫应答。簇细胞可位于上下呼吸道、胃肠道和泌尿生殖等组织上皮中,具有与味蕾II型味觉细胞相同的细胞形态、信号转导通路成分(如GNAT3、PLCB2、TRPM5)和基因表达谱[45]。

迄今为止,关于簇细胞的研究大多集中在胃肠道簇细胞中,而在呼吸道上皮细胞中较少,但与胃肠道簇细胞一样,呼吸道簇细胞也可以通过检测组织细胞内微生物衍生的化学物质来抵抗微生物感染。有研究发现,在上呼吸道黏膜组织中,簇细胞具有同时表达苦味受体和甜味受体2/3(Sweet taste receptor,TAS1R2/TAS1R3)的能力,其中簇细胞的化学免疫感应能力与抗菌肽的分泌以及肥大细胞脱颗粒有关[46]。当人鼻窦上皮簇细胞TAS2Rs被激活后,可通过甜味TAS1R2-TAS1R3配体(包括细菌来源的D-氨基酸)的抑制过程刺激邻近细胞释放抗菌肽,发挥抗菌作用,表明苦/甜味受体激活水平和功能状态的相互制衡可能是维护气道微生态环境和防御力的重要环节[46-47]。此外,簇细胞激活还可以释放IL-25,与呼吸道上皮细胞受外界有害物质刺激时产生的其他细胞因子(TSLP、IL-33)共同调节固有免疫[48]。有研究者发现,用苦味剂苯甲地那铵和铜绿假单胞菌衍生的群体感应分子AHLs可激活鼻窦上皮簇细胞和气道黏膜簇细胞TAS2Rs,引起簇细胞内的Ca2+浓度升高,增加ACh分泌,刺激三叉神经纤维上的化学感受器,进而产生神经源性肥大细胞介导的炎症反应和潜在的保护性呼吸中止反应[49]。此外,气道簇细胞的TAS2Rs级联反应还能通过自分泌功能协调细菌感染的2型免疫应答[50]。综上,在呼吸道中,苦味受体在防止细菌感染方面可能具有较好的防御作用。

3.4 TAS2Rs在免疫细胞中的研究 近年研究表明,TAS2Rs与多种免疫相关疾病有关,是机体全身免疫功能的核心化学感受器,其调节的免疫反应不仅能保护机体免受病原微生物的侵害,还能保持微生物群间的平衡。目前在外周血中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和肥大细胞等免疫细胞中,已明确发现表达功能性TAS2Rs[51-52]。

Maurer等[53]通过对7例志愿者的外周血进行细胞荧光测定,发现人体内中性粒细胞和单核细胞的TAS2R38与铜绿假单胞菌衍生的AHL-12特异性结合后,可激活细胞趋化及吞噬功能,在宿主对生物膜感染早期应答过程中具有重要意义。Sharma等[54]在尘螨(House dust mite,HDM)和卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)诱发的过敏性小鼠哮喘模型中证明了TAS2R激动剂(氯喹或奎宁)对免疫细胞浸润以及细胞因子/趋化因子在肺中的释放具有抑制作用。Gopallawa等[55]发现,在巨噬细胞中也表达TAS2Rs,来自细菌的苦味代谢物可刺激TAS2Rs并激活钙信号,导致NO合酶异构体激活和NO产生,产生的NO通过蛋白激酶G增加细胞cGMP水平,上调巨噬细胞的吞噬作用。当机体内cAMP水平升高时,巨噬细胞的TAS2Rs还可通过百日咳毒素(Pertussis toxin,PTX)依赖性途径,降低cAMP水平,以增强吞噬作用。此外,TAS2Rs激活还可通过拮抗LPS诱导的人外周血单核细胞和肺巨噬细胞炎症介质的产生而发挥抗炎作用[56]。TAS2Rs的抗炎活性与SNPs同样相关,与无功能的AVI/AVI双倍型相比,功能性PAV单倍型TAS2R38受体在激动剂刺激后表现出显著抑制TNF-α释放的作用[57]。在IgE受体激活的原代人肥大细胞中,TAS2Rs和TAS2Rs激动剂氯喹和苯甲地那铵结合可抑制组胺和PGD2的释放[58]。除此之外,在严重哮喘儿童的血液白细胞中也检测出较高水平的TAS2Rs表达,其受体激活不仅可抑制成人全血细胞中多种促炎细胞因子和花生四烯酸类物质的释放,还能避免白细胞迁移[59]。上述研究结果表明,TAS2Rs可通过调节NK细胞介导的细胞毒性、T细胞受体、趋化因子及TNF等信号转导通路,参与调节宿主免疫系统防御功能以及抑制细胞因子风暴。

3.5 TAS2Rs在肺癌细胞中的研究 TAS2Rs在各种口腔外细胞中表达并具有功能活性,其遗传变异性和由其激活引发的功能反应引起广泛关注。在癌症细胞中,TAS2Rs可参与调控细胞凋亡与增殖的重要生理过程。在胰腺癌细胞中,细菌代谢物(AHL-12)激活TAS2R38,可引起细胞内转录因子表达水平改变,使多重耐药蛋白ABCB1基因表达上调,降低肿瘤细胞的化疗耐药性[60]。研究表明,TAS2R10也可表达于人胰腺癌细胞中。当用苦味剂咖啡因刺激癌细胞,可激活TAS2R10抑制Akt磷酸化,进而下调另一种多重耐药蛋白ABCG2的表达,使细胞对化疗药物的敏感性增加[61]。此外,在人神经母细胞瘤细胞中,TAS2R8和TAS2R10激活具有诱导抗癌干细胞反应和抗肿瘤侵袭作用[62]。在前列腺癌和卵巢癌患者细胞中,TAS2R14激活可参与诱导细胞凋亡[63]。有报道,包括TAS2R4和TAS2R14在内的TAS2Rs多态性变异与癌症风险增加相关,与非癌细胞系相比,TAS2Rs在癌变中的基因表达主要以下调为主[64]。综上,TAS2Rs可存在于致癌细胞中并具有功能活性。

虽然目前还没有文献对TAS2Rs与肺癌之间的关系进行详尽报道,但根据TGGA癌症数据库(The Cancer Genome Atlas)收录的资料显示,在人肺腺癌和肺鳞癌病例中已有部分TAS2Rs基因拷贝数目发生改变。国内学者李松旻等[65]通过对POU2F3类簇细胞型小细胞肺癌系NCI-H526和NCI-H211进行基因表达和细胞功能研究,发现NCI-H211细胞和簇细胞有着诸多共同特征：表达苦味受体基因(11种)以及包括α-gustducin、Gγ13、PLCβ2和TrpM5在内的味觉转导蛋白。在H211细胞中,TAS2R10和TAS2R38表达水平较高,用苯甲地那铵和N-苯基硫脲分别刺激人小细胞肺癌系H211,可促进H211细胞中COX2表达和PGE2合成。可见TAS2Rs是预测治疗结果和指导治疗方案选择的潜在生物标志物,有望成为刺激癌细胞凋亡的治疗靶点,但TAS2Rs影响肺癌细胞凋亡的具体机制还需进一步研究确定。

4 小结

综上所述,苦味受体可在呼吸系统细胞中广泛表达,其激活具有舒张平滑肌、促进黏液-纤毛清除、抑制微生物感染、改善炎症及气道重塑等多种功效,对控制呼吸道疾病起到非常显著的效果,现已成为治疗此类疾病的理想候选成分。尽管已有较多进展,但仍有许多问题亟待解决,如探索人类肺组织编码的25种TAS2Rs细胞定位及其主要功能,呼吸道TAS2Rs激动剂在人体中的安全性和有效性。另外,由于TAS2Rs化学结构的多样性,其受体特异性激动剂及阻断剂的开发也亟待解决。总之,TAS2Rs应是一个有潜力的分子靶点。