坛紫菜不同品系丝状体的生产特性分析

陈嘉欣 王志超 杨 锐 骆其君 陈娟娟 陈海敏

（宁波大学，浙江省海洋生物工程重点实验室/海洋学院，浙江 宁波 315211）

紫菜是重要的大型经济海藻，于我国东部沿海广泛栽培。坛紫菜（Neoporphyra haitanensis）［1］的生产过程包括丝状体室内培育和叶状体海区养殖两个阶段。每年3 月中下旬，利用前一年采收的成熟叶片采集果孢子或利用保存的丝状体种质接种贝壳，待其钻入贝壳，生长成为贝壳丝状体。随后，丝状体扩增生长，并在高温缩光等条件下被诱导形成壳孢子囊枝。处暑至白露前后，经冷水刺激，成熟的壳孢子囊枝释放壳孢子。壳孢子附着在网帘上，萌发成叶状体［2］。叶状体在海区栽培养成，11月底至翌年的2月收获种菜。

近年来，由于秋季温度反弹，紫菜农场经常经历超过30 ℃的持续高温［3］，致使其易发生病烂，最终脱离栽培网，造成产量损失［4-5］。而且，在坛紫菜壳孢子采苗期间和海区栽培的前期，台风与高温天气时常发生，会影响壳孢子萌发和叶状体生长，严重时会引起大规模掉苗和烂苗，造成巨大经济损失［6-7］。因此，行业发展迫切要求开发产量高、抗性强的新品种作为产业支撑。

紫菜育种是通过人为方式改变藻体的某些性状，培育出能稳定遗传且具有优良性状的品种的过程［8］。目前坛紫菜有5 个国家审定的新品种，即申福1 号（GS-01-003-2009）、闽丰1 号（GS-04-002-2012）、申福2 号（GS-01-009-2013）、浙东1 号（GS-01-013-2014）和闽丰2 号（GS-01-010-2020）。这些新品种的育成与推广大大推动了紫菜产业的发展，但与生产需求相比，良种数量和可提供苗种数量均远远不足。

目前，关于紫菜抗高温机制的研究是藻类学家关注的热点［9-11］。在已有紫菜育种的研究报道中，多数为关注叶状体的性状分析，而对丝状体的评价及报道则较少。然而，丝状体选育是紫菜育种的首要环节，建立丝状体优良性状评价体系，对提高良种选育效率，缩短选育时间十分重要。因此，本试验以坛紫菜不同品系GS-1（选育品系）、MF-2（闽丰2号）和FJ-W18（福建野生种）的丝状体为研究对象，检测其在高温胁迫下的生长速率、光合参数、光合色素含量、初始藻落密度、壳孢子放散量等生产性状；通过品系间的比较分析，建立坛紫菜丝状体生产性状的评价指标，以期为筛选高抗高繁殖力的优良品系提供数据和理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

本研究采用的坛紫菜自由丝状体品系：选育品系（GS-1）和福建野生种（FJ-W18）为浙江省海洋生物工程重点实验室大型海藻种质库制备，闽丰2 号（MF-2）由集美大学谢潮添教授惠赠。

选取色泽鲜红、生长状态良好的自由丝状体进行试验。取文蛤壳刷洗干净，用2%～3%稀盐酸浸泡20 min 左右，继续刷洗至表面干净光洁，再次冲洗，晾干并灭菌。取约0.01 g 自由丝状体，粉碎机彻底粉碎至0.2～0.3 mm 左右的小段，用10～20 倍海水稀释，然后按照密度200～250 段·cm-2，均匀喷洒在贝壳上。

坛紫菜培养参照王素娟等［12］的方法，略有改动。丝状体接种贝壳完成后，先黑暗培养3 d，pH 值8.0±0.2，培养温度为（22±1） ℃。随后转为光周期：10 h 光照/14 h 黑暗，光照强度6 μmol photons·m-2·s-1。接种贝壳14 d 后，清洗贝壳并更换培养液，光照强度升至30 μmol photons·m-2·s-1，其他条件不变，每7 d 换一次水，使贝壳浸没在海水中。培养液为宁大Ⅲ号［13］母液与灭菌海水以1∶1 000（V/V）稀释。

1.2 仪器与设备

GXZ 型智能光照培养箱，宁波江南仪器厂有限公司；WATER-PAM 叶绿素荧光仪，德国Walz 公司；3001酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司；1-16K 离心机，德国Sigma 公司；ECLIPSE Ti 倒置荧光显微镜、SMZ18体式荧光显微镜，日本Nikon公司。

1.3 试验方法

1.3.1 不同品系坛紫菜丝状体相对生长率测定 将不同品系坛紫菜自由丝状体分别置于100 mL 锥形瓶中，在20、25、30、32 ℃条件下培养，培养时间为14 d，每个处理设置3 个重复。培养结束后将培养液用筛绢过滤，用镊子将丝状体挑出并用无菌滤纸吸附过多的水分，称量鲜重，统计数据。按照下列公式计算相对生长率（relative growth rate，RGR）：

式中，W0表示藻体初始重量（g），Wt表示试验结束后藻体鲜重，t表示培养天数（d）。

1.3.2 不同品系坛紫菜丝状体叶绿素荧光参数检测 分别在1、4、7 和14 d，按照文献［14］的方法，利用WATER-PAM 叶绿素荧光仪测定样品光系统Ⅱ（photo-system Ⅱ，PS Ⅱ）的最大光化学量子产量（maximum photochemical quantum of PSⅡ，Fv/Fm）。用筛绢收集鲜重约0.01 g藻体，用无菌海水冲洗，以清除表面杂质。将收集的丝状体暗处理15 min 后，测定其Fv/Fm。

1.3.3 不同品系坛紫菜丝状体叶绿素a 含量比较参照Wellvurn等［15］的方法测定不同品系坛紫菜自由丝状体中叶绿素a（chlorophyll a，Chl a）的含量。称取样本鲜重0.02 g，液氮研磨，加入5 mL 无水甲醇，将研磨后的样本转移至离心管中，4 ℃避光浸提24 h后混匀静置，取上清液。用酶标仪测定在750、665 和652 nm 处样本浸提液的吸光值，以无水甲醇作为空白对照。根据公式计算Chl a的含量（mg·g-1）：

式中，A750、A665、A652表示样本在750、665、652 nm波长下的吸光值，V 表示提取液的体积（mL），FW 表示藻体鲜重（g）。

1.3.4 不同品系坛紫菜丝状体藻胆蛋白测定 参照熊玉琴等［16］的方法测定坛紫菜自由丝状体中藻红蛋白（phycoerythrin，PE）和藻蓝蛋白（phycocyanin，PC）以及别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）的含量。准确称取各组别藻体0.02 g，液氮研磨后置于1.5 mL 离心管中，加入2 mL 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）。测定样品上清液于565、615 和650 nm 处吸光值，以PBS作为空白对照。PE、PC和APC含量（mg·g-1）的计算公式如下：

式中，A565、A615和A650表示样品在各波长下的吸光值，V为提取液的体积（mL），FW为丝状体鲜重（g）。

1.3.5 不同品系坛紫菜丝状体钻壳效率 参考孙霖清等［17］的方法，以丝状体钻入贝壳形成的初始藻落密度评估坛紫菜丝状体的钻壳效率。坛紫菜自由丝状体接种贝壳14 d 后，洗去贝壳表面多余的藻体，并更换培养液，每组随机选取8个贝壳，每个贝壳在体视显微镜下计数5个视野（放大倍数1×4）内的藻落个数，根据视野面积计算单位面积内的藻落个数，即初始藻落密度。

1.3.6 不同品系坛紫菜贝壳丝状体促熟和壳孢子放散量计数 接种完成后，各品系贝壳丝状体继续培养50 d 后，将培养温度升至29 ℃，光照强度30 μmol photons·m-2·s-1，光周期8 h 光照/16 h 黑暗，每7 d更换培养液，诱导贝壳丝状体形成壳孢子囊枝。培养85 d左右时，壳孢子囊枝成熟，将单个贝壳放入200 mL烧杯中，加入50 mL 培养液充气培养，温度降至（25±1） ℃，促进壳孢子放散。将50 mL 壳孢子水倒入直径为9 cm 的培养皿内，在倒置显微镜下，统计40 个视野（放大倍数10×10）内的壳孢子数，取其平均值，根据视野面积与培养皿的底面积，计算出每个培养皿内的壳孢子数，即单个贝壳的壳孢子日放散量。每个贝壳在壳孢子开始放散后连续计数3 d，其总和为该贝壳的总壳孢子放散量。每组贝壳全部计数，取其平均值，为该组的平均放散量。每个贝壳在壳孢子开始放散后连续计数3 d，其总和为该贝壳的总壳孢子放散量。每组贝壳全部计数，取其平均值，为该组的平均放散量。

1.3.7 不同品系坛紫菜壳孢子放散量 按照上述贝壳接种方法，移植14 d 后洗去贝壳表面多余丝状体，分别置于20、25、30 和32 ℃条件下培养，光照强度为10 μmol photons·m-2·s-1，光周期为14 h光照/10 h 黑暗，每7 d 更换一次培养液，每2 周拍照观察，促熟和壳孢子放散量计数同1.3.6。

1.3.8 数据统计与分析 采用Excel 2016、Designexpert-8、SPSS17.0 等统计软件进数据处理及统计分析，采用单因素方差（One-Way ANOVA）、多因素方差（Multi-Factor ANOVA）和t-test 分析，Origin 2018绘图。

2 结果与分析

2.1 不同品系坛紫菜丝状体相对生长率（RGR）

不同品系坛紫菜丝状体的相对生长率（RGR）如图1所示。在不同温度下，藻体相对生长率从大到小依次为20 ℃＞25 ℃＞30 ℃＞32 ℃，20 ℃是各品系最佳生长温度，此时FJ-W18 的相对生长率最高为2.72%，显著高于GS-1（2.35%，P＜0.05）和MF-2（1.34%，P＜0.05）。25 ℃时各品系坛紫菜丝状体的生长较20 ℃稍有下降，GS-1 的相对生长率为1.5%，显著高于MF-2（0.45%，P＜0.05）和FJ-W18（0.79%，P＜0.05）。30 ℃高温对紫菜丝状体的生长产生明显抑制作用，虽然MF-2 的相对生长率仍为正增长，但长幅极小，且GS-1 和MF-2的差异不显著；而FJ-W18 受高温影响最大。32 ℃是极限高温，各品系均呈现负增长。综合而言，FJ-W18虽然在20 ℃表现出高生长率，但其抗高温性状表现较差；GS-1的抗高温表现与MF-2无显著差异，但其生长速度更快，具有培育成为抗高温良种的潜质。

图1 坛紫菜丝状体在不同温度下的相对生长率Fig.1 RGR of the conchocelis of Neoporphyra haitanensis cultivars under different temperatures

2.2 不同品系坛紫菜丝状体叶绿素荧光参数差异

Fv/Fm通常反映植物的光合能力。在健康生理状态下，植物的Fv/Fm值稳定；当受到胁迫时，Fv/Fm下降［18］。由图2 可知，3 个品系坛紫菜丝状体Fv/Fm下降幅度由小到大依次为20 ℃＜25 ℃＜30 ℃＜32 ℃。在20 ℃下，3 个品系的Fv/Fm比较稳定（P＞0.05）。在25 ℃下，GS-1和MF-2表现相似，均较稳定，7 d后FJ-W18的Fv/Fm与1 d 相比极显著下降（P＜0.01）。在30 ℃下，GS-1和FJ-W18的Fv/Fm均在7 d时极显著下降（P＜0.01），而MF-2在7 d时较1 d显著下降（P＜0.05）。在32 ℃下，各品系丝状体Fv/Fm均在4 d时极显著下降（P＜0.01）。

图2 不同温度下坛紫菜品系丝状体的Fv/FmFig.2 Fv/Fm of the conchocelis of Neoporphyra haitanensis cultivars under different temperatures

2.3 不同品系坛紫菜丝状体叶绿素a含量差异

叶绿素a 是坛紫菜主要的光合色素，也是影响其光合作用的重要因子［19］。本研究测定了不同温度下不同品系丝状体的叶绿素a 含量，结果如图3 所示。20 ℃下，各品系叶绿素a 含量无显著变化；25 ℃时，各品系叶绿素a含量较20 ℃均有所下降，但比较稳定；30和32 ℃时，MF-2 丝状体叶绿素a 含量下降幅度大于GS-1 和FJ-W18；GS-1 叶绿素a 含量在30 ℃，7 d 时显著降低（P＜0.05），FJ-W18在32 ℃，7 d时显著降低（P＜0.05）。在所有温度下，GS-1叶绿素a含量均最高。

2.4 不同品系坛紫菜丝状体藻胆蛋白的差异

光合色素是藻类进行光合作用的物质基础，其中藻胆蛋白参与光能传递，起着至关重要的作用［20］。GS-1、MF-2和FJ-W18坛紫菜丝状体在不同温度下的藻红蛋白含量变化如图4所示。20 ℃时，3个品系坛紫菜丝状体的藻红蛋白含量未随时间发生显著变化。25 ℃时，不同品系藻红蛋白含量的降幅由大到小为FJ-W18＞GS-1＞MF-2。30 和32 ℃时，3 个品系的藻红蛋白含量下降幅度变大，且下降幅度由大到小为MF-2＞FJ-W18＞GS-1；其中，MF-2 在30 ℃和32 ℃下藻红蛋白含量下降最快，在32 ℃、14 d时，该数值接近于0。

图4 不同温度下坛紫菜品系丝状体藻红蛋白含量Fig.4 Phycoerythrin contents of the conchocelis of Neoporphyra haitanensis cultivars under different temperatures

坛紫菜丝状体在不同温度下的藻蓝蛋白含量变化如图5 所示。整体上MF-2 的藻蓝蛋白含量在不同温度下均为最高，其次为GS-1，FJ-W18 最低。20 ℃时，各品系的藻蓝蛋白含量随时间延长无显著变化。25 ℃时，GS-1 藻红蛋白含量随培养时间延长而下降，在7 d 时极显著降低（P＜0.01）；MF-2 藻蓝蛋白含量变化无显著差异；FJ-W18藻蓝蛋白含量变化明显，在4 d时极显著降低（P＜0.01）。在30 和32 ℃高温下，3 个品系的藻蓝蛋白含量下降趋势相同，且MF-2 藻蓝蛋白含量下降幅度大于GS-1和FJ-W18。

图5 不同温度下坛紫菜品系丝状体藻蓝蛋白含量Fig.5 Phycocyanin contents of the conchocelis of Neoporphyra haitanensis cultivars under different temperatures

坛紫菜丝状体在不同温度下的别藻蓝蛋白含量变化如图6 所示。20 ℃时，各品系的别藻蓝蛋白含量随培养时间延长无显著变化。25 ℃时，各品系的别藻蓝蛋白含量均呈下降趋势，且都在7 d 时呈显著性差异（P＜0.05）；30 和32 ℃时，各品系的藻蓝蛋白含量下降趋势相似，且降幅比25 ℃大，其中GS-1 和MF-2 别藻蓝蛋白含量降幅大于FJ-W18。

图6 不同温度下坛紫菜品系丝状体别藻蓝蛋白含量Fig.6 Allophycocyanin contents of the conchocelis of Neoporphyra haitanensis cultivars under different temperatures

2.5 不同品系坛紫菜丝状体钻壳效率的比较

GS-1 丝状体的初始藻落密度为5 760 个·cm-2，显著高于MF-2 和FJ-W18（P＜0.05）；是MF-2 丝状体初始藻落密度（4 167个·cm-2）的1.38倍，是FJ-W18丝状体初始藻落密度（3 360 个·cm-2）的1.71 倍（图7）。这表明GS-1丝状体具有更高的钻壳效率。

图7 坛紫菜品系丝状体的初始藻落密度Fig.7 Initial algal colony densities of the conchocelis of Neoporphyra haitanensis cultivars

2.6 不同品系坛紫菜壳孢子放散量的比较

当接种量相同，在不同温度培养14 d后，随温度升高，贝壳丝状体生长越快，但32 ℃时各品系贝壳丝状体的生长明显受到抑制，MF-2 和FJ-W18 贝壳几乎漂白，而GS-1 虽仍保留少量贝壳丝状体，但3～4 d 后同样全部漂白（图8-A）。经相同条件促熟后，各品系壳孢子放散量最高是在20 ℃下培养的贝壳丝状体，其次为25 ℃组，壳孢子放散量最低的是30 ℃组；GS-1贝壳丝状体壳孢子放散量在不同温度培养条件下均为最高，其次是MF-2 和FJ-W18（图8-B）。20 ℃时，GS-1壳孢子放散量显著高于MF-2和FJ-W（P＜0.05），25 ℃时，GS-1 壳孢子放散量显著高于FJ-W（P＜0.05），与MF-2 无显著差异，30 ℃时各品系壳孢子放散量均无显著差异（图8-C）。

图8 坛紫菜品系的壳孢子放散情况Fig.8 Numbers of conchospores released of Neoporphyra haitanensis cultivars

3 讨论

温度是影响坛紫菜丝状体生长发育的重要环境因子。研究表明，坛紫菜自由丝状体在19～23 ℃生长最快，且随着温度的上升，低于最适温度时促进生长，高于最适温度后减缓或抑制生长［21］。本研究中，GS-1在25 ℃中的生长表现优于MF-2 和FJ-W18，表现出较好生长特性，具备培育抗高温品系的潜力。坛紫菜自由丝状体能耐受的极限高温为29 ℃［21］，前人推测由于高温破坏藻体细胞结构，抑制相关“促进生长类”激素合成，导致藻体出现生长抑制现象［22-23］。本研究中，在30 ℃以上高温时，所有品系紫菜生长都受到明显抑制，与前人发现一致。

光合作用是植物响应热胁迫的关键生理过程之一。在光合组织中，光系统Ⅱ（photosystem Ⅱ，PSⅡ）被认为是最敏感的组分，主要限制应对环境扰动和胁迫（如高温、光强等）的光化学反应［24］。Fv/Fm值反映了光系统Ⅱ的最大光量子产量［25］，是藻类应对各种胁迫时响应最迅速的参数之一，其变化程度可以反映藻体受胁迫的强弱［26］。高温胁迫后紫菜PSⅡ受到损伤，导致Fv/Fm值下降［27］。本研究中，各品系丝状体在高温胁迫下PSⅡ的Fv/Fm值均极显著下降，证明该参数对筛选抗高温品系有较好评价参考，可用作抗高温筛选的指标。

光合色素的组成及其含量变化与藻体生理活性密切相关。叶绿素a是光合作用的中心色素［28］，叶绿素a在光和作用中直接参与光反应，叶绿素a 含量越高，光合能力越强，增产潜力越强［29-30］。藻胆蛋白是紫菜光合作用中重要的辅助色素，有利于藻类在自然界中的生存竞争［31］；同时，藻胆蛋白具有较强的抗氧化活性，在抗胁迫方面发挥着重要作用［32］。本研究中，在不同温度下，随时间延长，GS-1 丝状体叶绿素a 含量均高于MF-2 和FJ-W18。3 个坛紫菜品系的藻胆蛋白含量均随温度升高和培养时间延长而降低，且温度越高，藻胆蛋白含量降幅越大。虽然GS-1 丝状体藻胆蛋白含量稍逊低于抗高温良种MF-2，但GS-1 随温度和时间变化下降幅度显著低于MF-2 和FJ-W18。GS-1 光合色素指标的综合表现佐证了该品系具有抗高温的优势。因此，通过检测叶绿素a 和藻胆蛋白含量及其变化幅度也可以帮助筛选抗高温品系。

初始藻落密度高，说明自由丝状体钻壳效率高，能更快布满贝壳，形成更密的藻丝层［33］；壳孢子放散量提高表示丝状体能够产生更多生产用苗种［34］。因此，这两个参数可以作为筛选高繁殖力良种的指标。本研究中，在不同温度下GS-1 均比MF-2 和FJ-W18 有更高的初始藻落密度和壳孢子放散量，进一步说明该品系具备成为高繁殖力良种的潜力。

4 结论

本研究结果显示，相对生长率、最大光化学量子产量（Fv/Fm）、叶绿素a 和藻胆蛋白含量，以及自由丝状体钻壳效率（初始藻落密度）和贝壳丝状体壳孢子放散量等指标可以用于评价坛紫菜丝状体生长生理指标和生产性状，作为良种选育的重要参数。综合各指标发现，品系GS-1表现出较高的抗高温性能和高繁殖力，具备培育成良种的潜力。