脂联素及其受体在成年牦牛不同部位皮肤中的差异性分析

徐宏伟 崔 燕， 余四九， 李仕杰 张慧珠 何俊峰王 继 赵鹏飞

（1甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心，甘肃 兰州 730070）

牦牛主要生活在高原地区，其生存环境恶劣，常年遭受高寒、低氧和强紫外线等环境因素的侵袭。皮肤作为畜体与外界直接接触的最大器官，具有保护机体免受损伤和调节体温等功能，对牦牛在高寒地区维持正常生理活动具有重要意义［1-3］。皮肤主要由表皮和真皮组成，表皮位于皮肤表层，而毛囊、汗腺、皮脂腺、血管等皮肤附属结构位于真皮层内［4］。牦牛在适应高原环境的过程中，其皮肤结构发生了适应性的变化。研究表明，相较于平原牛种，高原牦牛的皮肤更厚，被毛也更密更长［5］；就成年牦牛本身而言，其颈部和腹部皮肤较其他部位的皮肤更厚，被毛更长，腹部的被毛也有着“裙毛”之称，牦牛皮肤的这些特点对牦牛保持体温，抵抗寒冷潮湿的环境具有积极作用［6］。以曹迷霞［7］和张虔等［8］对牦牛皮肤不同部位中毛囊密度的统计数据为标准，可将颈部和腹部的皮肤归为多毛皮肤，腋下和腹股沟的皮肤归为少毛皮肤。

牦牛皮肤对环境的适应能力不仅与其组织结构相关，更与其内部涉及的一些脂肪因子密不可分。皮肤的脂肪组织能够分泌多种因子并发挥相应的生物学功能。与其他部位的脂肪组织不同，皮肤上大部分的脂肪组织位于毛囊附近，起到促进毛囊生长发育的作用［9］。已有研究表明wnt 信号通路介导毛囊的生长发育，生长期毛囊向邻近的休止期毛囊发出信号，并将其激活为生长期毛囊，被激活的毛囊继续发出信号，激活与之邻近的休止期毛囊，进而使得整个皮肤的毛囊进入生长期［10-11］。脂联素（adiponectin，APN）是由脂肪细胞分泌的一种蛋白质，属于可溶性防御性胶原家族成员，含244 个氨基酸。APN 的受体主要为APNR1 和APNR2，具有7个跨膜结构域。已有研究表明，皮肤脂肪分泌的APN 及其受体可能通过自分泌的方式刺激皮肤脂肪分泌生长因子，继而影响毛囊的生长发育［12-13］，但APN、APNR1 和APNR2 在牦牛皮肤中的研究仍鲜见报道。

因此，本试验通过免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法、蛋白免疫印迹（western blot，WB）法对APN 及其受体（APNR1 和APNR2）的mRNA 和蛋白在成年牦牛皮肤不同部位上的定位和定量进行分析，并讨论其潜在的作用机制，旨在为哺乳动物皮肤的研究提供分子学的相关资料，为进一步探究牦牛在高原环境下的适应性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品与材料

1.1.1 试验动物和取材 在西宁市乐家湾屠宰场选取12 头状态良好的3～5 岁龄成年牦牛。颈部放血处死后，迅速采集毛囊处于生长期的颈部、腹部、腋下部和腹股沟部皮肤组织，用于IHC的样品放入4%的多聚甲醛溶液中进行固定，用于qRT-PCR 和WB 试验的样品迅速存放于液氮中，带回甘肃农业大学动物医学院实验室后移入-80 ℃冰箱中备用。

1.1.2 主要仪器和试剂 DP71 显微照相装置，日本Olympus 公司。链霉卵白素－生物素法检测（streptavidin peroxidase，SP） 试剂盒、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；脂联素多克隆抗体（Rabbit Anti-Adiponectin Polyclonal Antibody，bs-0471R）、脂联素受体Ⅱ多克隆抗体（Rabbit Anti-Adiponectin receptor 2 Polyclonal Antibody，bs-0611R）、脂联素受体Ⅰ多克隆抗体（Rabbit Anti-Adiponectin Receptor 1 Polyclonal Antibody，bs-0610R）和β-肌动蛋白/β-Actin（内参）多克隆抗体1［Rabbit Anti-beta-Actin （Loading Control）Polyclonal Antibody，bs-0061R］、二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG H&L（Goat Anti-Rabbit IgG H&L /HRP，bs-0295G-HRP），北京博奥森生物科技有限公司；放射免疫沉淀试验（radio immunoprecipitation assay，RIPA）组织裂解液、TriQuick 总RNA 提取剂，北京索莱宝科技有限公司；EVO-M-MLV 反转录试剂盒，长沙艾科瑞生物工程有限公司；Light Cycler 96 实时荧光定量PCR 仪，瑞士Roche公司；Q5000紫外分光光度计，美国Quawell 公司；HI1220 烘片机，上海徕卡仪器有限公司。

1.2 IHC检测

将组织样品从4%的多聚甲醛溶液取出，通过冲块、脱水、透明等步骤制成5 μm 厚的石蜡切片，置于烘片机上，60 ℃烘烤8 h。一抗APN、APNR1和APNR2 以1∶400 稀释。阴性对照用0.01 mol·L-1的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）代替一抗，按照SP试剂盒说明书进行处理。结果判定标准：棕色为阳性表达，接近背景色或无色为阴性。照片通过DP71 显微照相装置拍摄。

1.3 WB检测

将成年牦牛颈、腹、腋下、腹股沟4 个部位的皮肤样品充分研磨，各取100 mg 至离心管中；分别加入1 mL RIPA 组织裂解液和10 μL 苯甲基磺酰氟（phenylm methane sulfonyl fluoride，PMSF），摇床2 h 使研磨好的皮肤组织充分被裂解；然后12 000×g离心10 min，吸取上清液置于新的离心管中，-80 ℃条件下保存备用。将提取的蛋白与 4×SDS-PAGE loading buffer按3∶1的比例混合配置蛋白工作液，在恒温金属浴中100 ℃加热10 min。用等量变性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 （sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），通过湿转法将目的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗（APN、APNR1 和APNR2 都按1∶800 稀释）4 ℃孵育过夜。二抗经1∶2 500 倍稀释后室温孵育1 h，电化学发光液（electro-chemiluminescence，ECL）显色并观察结果，用Image J软件测定各条带灰度值。

1.4 qRT-PCR检测

取毛囊处于生长期的牦牛皮肤（颈部、腹部、腋下和腹股沟部），充分研磨后，采用TriQuick法提取4个不同部位皮肤组织的总RNA。通过紫外分光光度计测定其浓度，并将其浓度均调至200 ng·L-1，按照反转录试剂盒说明书步骤将其反转录为cDNA 后进行qRT-PCR 试验。反应体系为20 μL：SYBR Green Mix 10 μL，正向和反向引物各0.8 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7.4 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 个循环。反应完成后分析样品的Ct值并用2-ΔΔCt法分析数据。根据GenBank中已报道的野牦牛APN、APNR1、APNR2和β-actin内参基因序列，采用Primer Premier 6.0 软件设计特异性引物，通过生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 目的基因及内参基因引物序列Table 1 Primers sequence of target gene and β-actin

1.5 数据分析

数据用平均值±标准差（Mean±SD）来表示，用单因素ANOVA（SPSS25.0）进行统计学分析，P＜0.05 为差异显著。用GraphPad Prism 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 免疫组织化学检测结果

2.1.1 APN 在成年牦牛皮肤不同部位的分布与表达 APN在颈部、腹部、腋下和腹股沟皮肤中的表达部位基本相似，主要在表皮层、毛囊外根鞘、皮脂腺、汗腺、毛细血管内皮细胞中表达（图1）。

图1 成年牦牛不同部位皮肤中APN的分布Fig.1 Ditribution of APN in different parts of adult yaks skin

2.1.2 APNR1 在成年牦牛皮肤不同部位的分布与表达 APNR1 在颈部、腹部、腋下和腹股沟皮肤中的表达部位基本相似，主要在表皮层、毛囊外根鞘、皮脂腺、汗腺、毛细血管内皮细胞中表达（图2）。

图2 成年牦牛不同部位皮肤中APNR1的分布Fig.2 Ditribution of APNR1 in different parts of adult yaks skin

2.1.3 APNR2 在成年牦牛皮肤不同部位的分布与表达 APNR2 在颈部、腹部、腋下和腹股沟皮肤中的表达部位基本相似，主要在表皮层、毛囊外根鞘、皮脂腺、汗腺、毛细血管内皮细胞中表达（图3）。

2.2 WB检测结果

2.2.1 APN 在成年牦牛不同部位皮肤的蛋白表达WB 结果显示，APN 在成年牦牛不同部位皮肤均有表达。各部位皮肤表达量中，颈部最高且显著高于其他部位（P＜0.05），其次为腹部，显著高于腋下和腹股沟（P＜0.05），腹股沟的表达量略高于腋下，但两者之间差异不显著（图4）。

图4 成年牦牛不同部位皮肤APN蛋白表达量Fig.4 Expression of APN protein in different parts of skin of adult yak

2.2.2 APNR1和APNR2在成年牦牛皮肤不同部位的蛋白表达 WB 结果显示，APNR1 和APNR2 在成年牦牛不同部位皮肤均有表达，APNR1 在各部位皮肤表达量中，颈部最高且显著高于其他部位（P＜0.05），其次为腹部，显著高于腋下和腹股沟（P＜0.05），腹股沟的表达量略高于腋下，但两者之间差异不显著（图5）；APNR2在各部位皮肤表达量为颈部＞腹部＞腹股沟＞腋下（P＜0.05，除腹股沟与腋下）（图6）。通过对比APNR1 和APNR2 蛋白表达量，发现皮肤上APNR1 的蛋白表达水平高于APNR2，且在颈部和腹部之间差异显著（P＜0.05，图7）。

图5 成年牦牛不同部位皮肤APNR1蛋白表达量Fig.5 Expression of APNR1 protein in different parts of skin of adult yak

图6 成年牦牛不同部位皮肤APNR2蛋白表达量Fig.6 Expression of APNR2 protein in different parts of skin of adult yak

图7 APNR1和APNR2蛋白表达量的结果对比Fig.7 Comparison of APNR1 and APNR2 protein expression levels

2.3 qRT-PCR检测结果

2.3.1APN在成年牦牛皮肤不同部位的转录水平APN的mRNA 在成年牦牛不同部位的皮肤中均有表达，其在腹股沟部位皮肤表达量最高且显著高于其他部位（P＜0.05），腹部表达量最低且显著低于其他部位（P＜0.05），颈部的表达量高于腋下，但二者之间差异不显著（图8-A）。

图8 成年牦牛不同部位皮肤APN及其受体APNR1和APNR2转录水平Fig.8 Transcription levels of APN and its receptor APNR1 and APNR2 in different parts of adult yak skin

2.3.2APNR1在成年牦牛皮肤不同部位的转录水平APNR1的mRNA在成年牦牛不同部位的皮肤中均有表达，其在颈部皮肤表达量最高且显著高于其他部位（P＜0.05），其次为腹股沟，其表达量显著高于腹部和腋下（P＜0.05），腹部的表达量高于腋下，但二者之间差异不显著（图8-B）。

2.3.3APNR2在成年牦牛皮肤不同部位的转录水平APNR2的mRNA 在成年牦牛不同部位的皮肤中均有表达，其在颈部皮肤的表达量最高且显著高于其他部位（P＜0.05），腹股沟部位表达量最低且显著低于其他部位（P＜0.05），腹部的表达量高于腋下，但二者之间差异不显著（图8-C）。

3 讨论

牦牛是高原环境下的主要畜种，其被毛系统对其适应高寒、低氧和强紫外线等环境因素的侵袭有重要作用［1-3］。毛发的生长是一个复杂的过程，受到多种因子的调控，一部分因子来源于皮肤脂肪细胞，主要通过旁分泌和自分泌方式调控毛囊发育，其中APN、APNR1 和APNR2 均为来源于脂肪细胞的一类与毛发生长有关的蛋白质［12-13］。

本研究通过对成年牦牛不同部位皮肤中APN 及其受体APNR1 和APNR2 蛋白表达量的检测发现，APN、APNR1 和APNR2 的表达趋势基本相同，均在多毛部位（颈部和腹部）表达量较高，少毛部位（腋下和腹股沟）表达量较低，这表明APN、APNR1和APNR2的表达可能与毛发的生长有关。Won 等［14］研究表明，APN是一种毛发生长刺激剂，能够在体外促进人类毛囊的发育。由此推测APN 及其受体APNR1 和APNR2 在体内同样能够促进毛发的生长。近年有研究表明，APN可能通过激活Wnt/β-catenin 通路调节脂肪细胞产生多种脂肪因子［15］，进而调控毛囊的发育［16-18］。结合本研究结果，推测APN 及其受体APNR1 和APNR2 可能通过激活Wnt/β-catenin 通路来刺激毛发的生长。WB检测结果发现，APNR1 蛋白水平明显高于APNR2，这表明APN在皮肤上主要通过受体APNR1发挥作用，而APNR1是球形脂联素的高亲和受体，由此推测APN 在皮肤上发挥主要作用的构型是球形脂联素，且通过APNR1发挥作用。qRT-PCR 结果显示，APN和APNR1在RNA 水平上都是在颈部和腹股沟表达较高，APNR2则在颈部表达量最高，腹股沟表达量最低，表明APN及其受体APNR1和APNR2在RNA 水平与蛋白水平的表达有一定差异性。出现这种差异的原因可能是基因的降解特性导致的，从基因到可以发挥生物学功能的蛋白质需要经历一系列复杂的生物学过程，这些过程中的独特调控机制可能会导致测量结果中蛋白和mRNA 表达水平出现差异。与本研究结果相似，Fujitomo 等［19］同样指出APNR1和APNR2的转录表达谱不同于脂联素本身，导致其蛋白水平和mRNA 水平表达不一致。

前人研究表明，APN 及其受体APNR1 和APNR2在犬和小鼠皮肤中的表达规律类似，主要集中在皮肤毛囊、血管、汗腺和角质形成细胞等部位［20］，推测与APN 的功能有关。还有研究表明，脂联素能够通过减轻氧化应激来调控缺氧造成的血管内皮细胞损伤和凋亡［21］；APN 及其受体APNR1 和APNR2 在表皮和汗腺表达，也与皮肤的组织再生和创伤愈合有关［22-24］；Fiaschi 等［25］揭示了APN 在组织再生和创伤愈合中的重要作用，表明APN 缺乏会显著抑制组织的再生；同时，APN 可以通过促进表皮角质形成细胞的增殖和加强该细胞的迁移能力来恢复APN 缺陷小鼠受损的再上皮化［26-27］。皮脂腺富含脂肪，由毛囊上的多能干细胞分化产生［28］，能够分泌多种细胞因子，包括APN、APNR1 和APNR2，前人研究发现这3 个因子与毛囊的发育密切相关［29］。本研究IHC结果显示，APN、APNR1和APNR2 表达的部位基本相似，主要在毛囊的外根鞘、血管内皮细胞、汗腺细胞、皮脂腺细胞和表皮各层角质形成细胞中表达。综上，这3 个因子与毛发的生长和皮肤正常生理功能的维持密切相关，对牦牛适应高原低氧环境有积极作用。此外，位于毛囊上皮根鞘的毛囊干细胞是毛囊能够生长发育的基础，其能在以Wnt信号通路为代表的多种复杂信号通路的共同作用下被激活成为短暂扩增细胞，从而启动毛囊干细胞增殖分化并开启毛囊的生长期［30］。APN 及其受体APNR1 和APNR2 在毛囊上皮根鞘的表达可能与其促进毛发生长的功能有关。综上，APN、APNR1 和APNR2 不仅能够维持皮肤正常的生理生化功能，而且能够促进毛囊的发育，这有效加强了牦牛对高原环境的适应性。

4 结论

本研究在成年牦牛皮肤中检测了APN 及其受体APNR1和APNR2的表达和分布。结果表明，APN及其受体可能在维持皮肤正常的生理生化功能和促进毛囊的发育方面发挥重要作用，有效地加强了牦牛对高原环境的适应性。同时通过对比APNR1 和APNR2 蛋白表达量，推测APN 在皮肤上主要通过APNR1 发挥作用，但具体作用机制有待进一步研究。