电子加速器辐照对红花粉末及水提液微生物及羟基红花黄色素A含量的影响

余杨健 谢和兵 ， 尼玛次仁 ， 白玛旦增 ，

（1安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230013；2南通市海门长三角药物高等研究院，江苏 南通 226133；3江苏神猴医药研究有限公司，江苏 南通 226133；4西藏神猴药业有限责任公司，西藏 日喀则 857000）

红花（Carthamus tinctoriusL.）属菊科一年生草本植物，多分布于新疆、云南、西藏、四川等地，具有活血化瘀、通经止痛的功效［1］。红花作为中药制剂中出现频率较高的单味药，是桃红四物汤、二十五味珍珠丸等中成药的重要原料药之一［2-3］。红花被卫生部列为药食同源类花类品种，还兼作染料、饲料等的原料［4］。红花中含有丰富的黄酮类［5］、生物碱［6］、苷类［7］、甾醇［8］、多糖［9］等成分，现代药理学对红花中的黄酮类成分研究最多。黄酮类成分主要包括羟基红花黄色素A、槲皮素、芦丁和山柰酚等，《中华人民共和国药典》（2020 版）中同时将羟基红花黄色素A 和山柰酚列为红花药材的含量质检指标［10］。其中羟基红花黄色素A是红花的水溶性有效成分，属于单查尔酮苷类化合物［11］，具有抗心肌缺血损伤［12-14］、抗炎［15-16］、抗帕金森病［17-18］、抗血栓［19］、降血糖［20］等多重药理作用。

红花药材在种植、贮藏、加工炮制过程中常会引入微生物，而微生物超标会影响药材和成品的质量，因此，在制剂的生产过程中常需对原料药材、中药提取物或制剂成品进行灭菌处理。目前常用的中药灭菌方法包括干热灭菌、微波灭菌、过热蒸汽灭菌、辐照灭菌等［21］。红花中的有效成分羟基红花黄色素A对光、热敏感［22-23］，易受外界条件的影响而发生改变［24-25］，常规的湿热、干热等灭菌工艺均会对红花的质量产生不利影响。而辐照灭菌技术是利用电离辐射产生的电磁波直接作用于物体分子结构来杀灭微生物的一种方法，属于“冷灭菌”工艺。与其他灭菌方法相比，辐照灭菌反应温和、灭菌迅速、不会破坏药物的有效成分，且不会残留有害物质［26］，适用于含热敏性成分中药材的灭菌处理［27-28］，目前已广泛应用于中药材、药品、食品、医疗器械等灭菌领域。2020 版《中华人民共和国药典》中的“辐射灭菌法”规定“能够耐辐射的医疗器械、生产辅助用品、药品包装材料、原料药及成品等均可用本法灭菌”［29］。辐照灭菌技术包括60Co 辐照灭菌和电子加速器辐照灭菌。电子加速器辐照灭菌技术被誉为“21 世纪绿色灭菌加工技术”，可以通过发射高能电子束对药物进行灭菌，与60Co辐照灭菌相比更安全环保、能耗更低，能量利用率高且不产生核废物［30-32］。

本研究通过不同强度的电子束辐照处理红花药材，比较辐照前后红花粉末和红花水提液性状、显微、薄层、微生物及羟基红花黄色素A含量变化，旨在为红花和含红花制剂的辐照灭菌提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红花购于西藏神猴药业有限责任公司，经江苏神猴医药研究有限公司鉴定为菊科植物红花（Carthamus tinctoriusL.）的干燥花；羟基红花黄色素A 对照品（纯度为96.8%）、红花对照药材，中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司；磷酸（优级纯），甲酸、丙三醇、乙酸、乙酸乙酯、丙酮为分析纯，国药集团化学试剂有限公司（上海）。

1.2 主要仪器与设备

20B高效万能粉碎机，常州市强迪干燥设备有限公司；WMS-1037生物光学显微镜，上海无陌光学仪器有限公司；SHZ-A 双数显水浴恒温振荡器、UC-250DE 超声清洗仪，上海精其仪器有限公司；Essentia LC-16 高效液相色谱仪，日本岛津公司；DZ-10/20 电子加速器，安徽戈瑞电子科技股份有限公司；XSR205DU/AC 十万分之一天平，美国梅特勒托利多科技有限公司；数显电热套，杭州振和科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理及辐照剂量的选择 用20B 高效万能粉碎机将红花药材粉碎成粗粉，过3 号筛（50 目）。将红花粉末分为6组，装入透明PET瓶中，每组4瓶，每瓶15 g，即得红花粉末组。取红花粉末30 g 置于圆底烧瓶中加12 倍水回流提取3 次，每次0.5 h，合并水提液。将红花水提液分为6 组，装入透明PET 瓶中，每组3 瓶，每瓶40 mL，即得红花水提液组。所有试验用辐照样品均由中广核戈瑞科技有限公司采用电子加速器进行辐照灭菌处理，辐照剂量分别为0、4、6、8、10 kGy。

1.3.2 性状观察 通过日光下目视、手触、鼻嗅、口尝等方式对红花粉末和红花水提液外观、色泽、气味、味道等进行直观判断［33］。

1.3.3 显微鉴别 参照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则2001 显微鉴别法［29］，取红花粉末过5 号筛（80 目），挑取少量置于载玻片上，滴加甘油醋酸试液，盖上盖玻片，置于WMS-1037生物光学显微镜下观察。

1.3.4 薄层色谱定性鉴别 分别取径0、4、6、8、10 kGy 剂量辐照灭菌处理的红花粉末各0.5 g 于具塞锥形瓶中，加80%丙酮5 mL，密塞，置于SHZ-A双数显水浴恒温振荡器中振摇15 min，静置，用玻璃漏斗过滤，取滤液作为红花供试品溶液。另取红花对照药材0.5 g，同法制成红花对照品溶液。参照《中华人民共和国药典》2020 年版四部通则0502 薄层色谱法［29］，吸取红花对照品溶液和上述各供试品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶H 薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇（7∶2∶3∶0.4，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干。

1.3.5 羟基红花黄色素A含量测定

1.3.5.1 色谱条件 色谱柱：Ultimate XB-C18 液相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：403 nm；进样量：10 μL。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3 000。

1.3.5.2 对照品溶液的制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品13.23 mg于100 mL容量瓶中，加25%甲醇定容，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得羟基红花黄色素A对照品溶液，浓度为0.13 mg·mL-1。

1.3.5.3 红花粉末供试品溶液的制备 取红花粉末约0.4 g 置于具塞锥形瓶中，加入25%甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）40 min，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得红花粉末供试品溶液。

1.3.5.4 红花水提液供试品溶液的制备 取红花水提液5 mL 置于10 mL 容量瓶中，加25%甲醇定容，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液，即得红花水提液供试品。

1.3.5.5 羟基红花黄色素A 含量测定 吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按1.3.5.1色谱条件用Essentia LC-16 高效液相色谱仪测定，记录目标峰峰面积，采用外标法计算红花粉末和红花水提液中羟基红花黄色素A含量。计算公式如下：

红花粉末中羟基红花黄色素A含量=（供试品溶液峰面积×对照品溶液浓度）/（对照品溶液峰面积×供试品溶液浓度）×100%；

红花水提液中羟基红花黄色素A含量=（供试品溶液峰面积×对照品溶液浓度×供试品溶液稀释倍数×红花水提液总体积）/（对照品溶液峰面积×红花质量）×100%。

1.3.6 微生物限度测定 参照《中华人民共和国药典》2020 年版四部通则1105 微生物计数法、1106 控制菌检查法和1107非无菌药品微生物限度标准［29］，对辐照前后红花粉末和红花水提液细菌总数、霉菌和酵母菌总数及大肠菌群进行检查。

1.4 数据分析

采用SPSS 26.0 软件进行统计学分析，辐照前后含量数据比较采用单因素方差分析中的事后多重比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 辐照前后性状观察

由图1 可知，辐照前后红花粉末和红花水提液外观、色泽、气味均未发生明显变化。红花粉末呈红黄色或红色，质柔软，气微香，味微苦；红花水提液呈棕褐色，气微香，味苦涩。说明电子加速器辐照灭菌对红花粉末和红花水提液性状无明显影响。

图1 辐照前后红花粉末和红花水提液性状Fig.1 Characteristics of safflower powder and safflower aqueous extract before and after irradiation

2.2 辐照前后红花粉末的显微鉴别

由图2可知，红花粉末辐照前在显微镜下可见花冠、花丝、柱头碎片分布，有长管状分泌细胞位于导管旁，含黄棕色至红棕色分泌物。花冠裂片顶端表皮细胞外壁突起呈短绒毛状。柱头和花柱上部表皮细胞分化成圆锥形单细胞毛，先端尖或稍钝。花粉粒类圆形、椭圆形或橄榄形，具3个萌发孔，外壁有齿状突起。草酸钙方晶常见于薄壁细胞中。辐照后上述显微特征均能看到，说明电子加速器辐照灭菌未明显改变红花粉末显微特征。

图2 红花粉末辐照前后显微特征（10×40）Fig.2 Microscopic characteristics of safflower powder before and after irradiation （10×40）

2.3 辐照前后红花粉末薄层鉴别

在供试品色谱中，经0、4、6、8、10 kGy 辐照剂量辐照的红花粉末在与红花对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，说明电子加速器辐照灭菌未明显改变红花粉末薄层色谱（图3）。

图3 红花粉末辐照前后薄层色谱图Fig.3 Thin layer chromatogram of safflower powder before and after irradiation

2.4 辐照前后红花粉末和红花水提液中羟基红花黄色素A含量变化

不同剂量辐照下红花粉末和红花水提液中羟基红花黄色素A 含量测定高效液相色谱图见图4 和图5。结果表明，辐照前后目标峰图谱无明显改变。辐照前后红花粉末及其水提液中羟基红花黄色素A含量测定结果如表1 所示，统计学分析表明，辐照前后红花粉末羟基红花黄色素A含量无显著变化；与辐照前相比，辐照后红花水提液羟基红花黄色素A 含量明显下降，其中6、8、10 kGy组均具有显著性差异。

表1 不同辐照剂量对红花中羟基红花黄色素A含量的影响（n=2）Table 1 Content of hydroxysafflor yellow A before and after irradiation of safflower powder and safflower aqueous extract （n=2）

图4 不同辐照剂量下红花粉末高效液相色谱图Fig.4 High performance liquid chromatography of safflower powder under different irradiation doses

图5 不同辐照剂量下红花水提液高效液相色谱图Fig.5 High performance liquid chromatography of safflower aqueous extract under different irradiation doses

2.5 微生物限度变化

辐照前红花粉末和红花水提液微生物限度均不符合《中华人民共和国药典》2020 年版四部通则中非无菌药品微生物限度标准（细菌总数≤2×103CFU·g-1，霉菌和酵母菌总数≤200 CFU·g-1，控制菌大肠埃希菌不得检出）［29］。辐照后细菌总数、霉菌和酵母菌总数均显著下降（P＜0.05），分别采用6 kGy和4 kGy辐照剂量辐照时，红花粉末和红花水提液霉菌和酵母菌总数及大肠菌群总数达到药典规定标准，但细菌总数仍很高，当辐照剂量为10 kGy 时，红花粉末和水提液细菌总数达到药典规定水平（表2）。

表2 不同辐照剂量对红花微生物限度的影响（n=2）Table 2 Effect of different irradiation doses on microbial limit of safflower（n=2）

3 讨论

3.1 电子加速器辐照对红花及其水提液定性指标的影响

中药材的质量变化情况通常从性状显微、薄层鉴别三个方面进行初步定性判断。性状是考察药材质量变化最直观的指标，显微鉴别可以确定药材固有的组织、细胞、内含物特征，薄层鉴别可以对药材的主要化学成分进行定性比对。但中药材的成分复杂，尤其是含有淀粉、挥发油、蛋白质等物质的中药材性状、显微等定性指标易在加工炮制、热灭菌等过程中发生显著变化。辐照灭菌技术最大的优势在于灭菌过程中不改变药材的温度，属于一种冷灭菌技术，对药材的性状等定性指标影响较小。本研究表明，电子加速器辐照后，红花及其水提液性状、显微、薄层鉴别均无明显改变，符合电子束辐照作用温和、无残留的特点。

3.2 电子加速器辐照对红花及其水提液有效成分含量变化的影响

红花及其相关制剂的灭菌方式一般采用湿热灭菌，但红花中的羟基红花黄色素A 在受热和碱性条件下极不稳定，会降解成对羟基苯甲醛和对羟基肉桂酸［34］。羟基红花黄色素A 的不稳定性可能与其分子结构中所含的官能团有关，羟基、羧基等基团的存在导致黄酮类的B 环与A 环脱离，从而降低了羟基红花黄色素A 的稳定性［35］。本研究发现，经电子束辐照后，红花粉末中羟基红花黄色素A 含量未发生显著变化，而红花水提液中有效成分羟基红花黄色素A含量整体显著下降，其原因可能是在水溶液状态下，电子束穿透性更高，高能电子束直接作用于细菌的遗传物质结构达到杀菌的同时，使水发生电离产生具有强氧化性的氧离子［36］，增加了羟基红花黄色素A 分子的不稳定性；而在干燥粉末状态下，含水量较低，电子束穿透性降低，高能电子束杀菌的同时产生的氧离子较少，对羟基红花黄色素A 分子的稳定性影响较小。此外，已有研究发现红花醇提液经60Co 辐照灭菌后，羟基红花黄色素A 含量发生了显著变化［37］，这与本试验结果一致。由此推断，含红花的水或乙醇提取物及以羟基红花黄色素A为活性成分的水溶液或乙醇溶液制剂均不宜采用电子束、60Co辐照的方法进行灭菌。

3.3 电子加速器辐照对红花及其水提液微生物的影响

红花在田间种植、人工采摘、自然晾干、储存等过程中容易被微生物污染，1997年卫生部发布的《60Co辐射中药灭菌剂量标准》中将红花列为允许辐照的中药材品种之一［38］。辐照技术可以通过发射高能射线直接或间接作用于微生物的生物大分子，如核糖核酸、酶、蛋白质等，破坏其结构，从而达到抑制或杀死微生物的效果，具有广谱性，但不同微生物对电离辐射的敏感性不同。本研究表明，与辐照前相比，4～10 kGy 辐照处理均能显著降低细菌总数、霉菌和酵母菌总数，且辐照剂量与细菌总数、霉菌和酵母菌总数呈负相关，说明红花及水提液中的微生物对电子束的敏感性较高。

4 结论

本研究结果表明，含红花的水提物以及以羟基红花黄色素A为活性成分的水溶液制剂不宜采用电子束辐照进行灭菌，而红花粉末以及以羟基红花黄色素A为活性成分的固体制剂可用电子束辐照进行灭菌，为红花和含红花制剂的辐照灭菌提供了参考依据。