60Co-γ辐照蓝莓钙形态和亚细胞钙分布对果实硬度的影响

王 琛 陶 烨 韩艳秋 张 锐 高 雅 李莉峰

（辽宁省农业科学院食品与加工研究所，辽宁 沈阳 110161）

蓝莓（Vacciniumspp）是一种蓝色或深紫色圆形浆果，采后极易软化失水，遭受微生物的侵染，导致货架期十分短暂［1-2］。硬度作为蓝莓果实的重要感官品质，是决定其消费性、耐贮性和抗病性的关键因素［3-4］。研究表明，γ 辐照对蓝莓果实硬度有积极影响，有利于蓝莓的长期贮藏和长途运输［5-7］。作者前期研究也发现，适当剂量的60Co-γ 辐照能够启动防御系统，抑制呼吸作用和活性氧代谢，有效地稳定细胞壁结构，延缓冷藏蓝莓果实的软化［8-10］。但有关60Co-γ 辐照对冷藏蓝莓果实硬度的调控机理尚不清楚。贾展慧等［11］认为辐照在一定程度上会损伤果肉细胞膜系统，通过干扰基础代谢过程促使细胞壁与膜系统的钙含量增加，从而提高果实硬度。

钙是植物细胞中的必需矿物质元素，在细胞膜和细胞壁的稳定、多种酶的调控、离子的渗透调节等方面具有重要作用［12］。钙在植物体内有多种存在形态，主要包括游离态和结合态两种。根据配体分子量大小，结合钙又分为小分子配体结合钙和大分子配体结合钙［13］。细胞质内游离态钙（Ca2+）浓度变化与Ca2+信号传导有关［14］。小分子配体结合钙包括草酸钙、磷酸钙、硅酸钙以及多酚钙等，主要分布在液泡、叶绿体、线粒体等细胞器中；大分子配体结合钙包括果胶结合钙和蛋白结合钙等，主要分布在细胞壁上［15］。植物在生长发育和成熟老化过程中，不同形态的钙会发生相互转变，以完成复杂的生理活动［16］。

鉴于60Co-γ 辐照对冷藏蓝莓果实硬度的积极影响，有必要进一步探明辐照蓝莓果实钙形态和钙分布对果实硬度的影响。本研究采用0.5、1.5、2.5 kGy 辐照剂量处理蓝丰蓝莓，以未辐照为对照（CK），研究不同辐照剂量对果实硬度、果肉总Ca 含量、不同溶解性Ca含量和Ca在亚细胞分布的影响，以及上述指标与冷藏蓝莓果实硬度的相关性，旨在为揭示辐照抑制冷藏蓝莓果实软化的作用机制提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓品种为蓝丰，采摘于沈阳时圣蓝莓基地，果实成熟饱满，大小色泽一致，且无病虫害与机械损伤。采后蓝莓分装于带气孔的PET保鲜盒中（净重125.0 g/盒），并于当日运回辽宁钴源辐照中心。

硝酸、高氯酸、去离子水、氯化钠、乙酸、盐酸、蔗糖、氨基丁三醇、二硫赤藓糖醇均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司（沈阳）。

1.2 主要仪器与设备

CT3-10K 型质构仪，美国Brookfield 公司；3200 型原子吸收分光光度计，安捷伦科技（中国）有限公司（北京）；HH-6数显恒温水浴锅，常州国华仪器厂；PB-10型pH 计，北京赛多利斯仪器系统有限公司；ZK-82B 电热真空干燥箱，上海实验仪器厂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 辐照处理 采用静态辐照方式，源强为7.51×1015Bq。设定辐照剂量为0、0.5、1.5、2.5 kGy，辐照均匀度在1.03～1.07之间。辐照时间统一为72 min，辐照中途需360°翻转。每组样品重复辐照3次，然后置于（5±0.5） ℃冷库贮藏。每隔5 d随机抽取样品，测定各指标。

1.3.2 测定指标与方法

1.3.2.1 果实硬度 每组样品随机挑选10 粒蓝莓，在果实轴中心位置，用CT3-10K 型质构仪测定蓝莓的果实硬度［8］。测试仪探头直径为2 mm，测试速度为1.0 mm·s-1，压入深度为5.0 mm。记录数据，取平均值。

1.3.2.2 果肉Ca 含量 参考Manganaris 等［17］的方法，分别称取烘干的果肉50 mg，置于消煮管中，HNO3-HCIO4混合消化，用原子吸收分光光度计测定消化液的Ca含量。

1.3.2.3 Ca 的结合形态 参考刘剑锋等［18］的方法，称取蓝莓果肉20 g，分别采用去离子水、1 mol·L-1氯化钠、2%乙酸和5%盐酸逐级依次提取水溶性Ca、NaCl溶性Ca、HAc 溶性Ca 和HCl 溶性Ca。所得各残渣经65 ℃烘干后，于HNO3-HClO4混合消化，用原子吸收分光光度计测定消化液的Ca含量。

1.3.2.4 Ca 的亚细胞分布 参考朱国奇等［19］的方法，取10 g 冷冻蓝莓果肉，加入5 倍的预先冷却缓冲液（内含250 mmol·L-1蔗糖，50 mmol·L-1Tris，1 mmol·L-1二硫赤藓糖醇，pH 值7.5）液氮匀浆。所得浆液于200×g离心2 min 得到第一部分细胞壁残渣，再将上清液于15 000×g离心45 min 得到第二部分细胞器残渣，上清液为细胞质，分离所得样品于4 ℃保存备用。

将蓝莓果肉、细胞壁残渣、细胞器残渣和细胞质上清液用去离子水转入烧杯中，60 ℃烘干后加入HNO3-HC1O4（5∶1）消煮至澄清，再用去离子水定容至50 mL，采用原子吸收分光光度计测定各组亚细胞组织中的各组分Ca含量。

1.4 数据统计

每组处理中每个指标均重复测定3次，所有数据用MS-Excel®（2013）软件处理，表示为平均值±标准偏差，用SPSS 17.0 统计软件进行单因素方差分析（ANOVA）和Pearson相关性分析，只对差异显著（P＜0.05）的结果进行讨论分析。

2 结果与分析

2.1 辐照处理对蓝莓果实硬度和果肉Ca含量的影响

如图1-A 所示，随着贮藏时间的延长，CK（0 kGy）组蓝莓的果实硬度逐渐下降，贮藏30 d时下降到0.73 N，显著低于1.5 kGy 和2.5 kGy 辐照组。辐照处理后，蓝莓果实硬度发生了不同程度的变化，其中0.5 kGy辐照处理组果实硬度变化不大，整个贮藏期间与CK组基本一致，始终处于最低的水平，而1.5 kGy和2.5 kGy辐照组果实硬度呈先上升后下降的趋势，且在贮藏15 d时达到峰值，与CK组差异显著。综上，辐照能够抑制冷藏后期蓝莓果实硬度下降，且抑制效果与辐照剂量成正比。

图1 不同辐照剂量对冷藏蓝莓果实硬度和果肉钙的影响Fig.1 Effect of different radiation doses on fruit firmness and pulp Ca content of refrigerated blueberry fruits

如图1-B 所示，辐照处理后（贮藏0 d），各组蓝莓果肉Ca 含量差异不显著，说明蓝莓果肉Ca 含量对辐照刺激的响应不积极。冷藏期间，蓝莓果肉Ca含量的变化也不明显，且各组间无显著差异，总体水平保持在40.05～43.03 mg·100 g-1FW 之间，说明辐照对冷藏蓝莓果肉Ca含量无明显影响。

2.2 辐照处理对蓝莓果实钙结合形态的影响

如图2-A 所示，辐照处理后（贮藏0 d），各组蓝莓果实水溶性Ca 含量均有所升高，其中2.5 kGy 辐照组最高，1.5 kGy 辐照组次之，0.5 kGy 辐照组与CK 组接近，处于较低水平，说明水溶性Ca含量对辐照刺激响应积极，且其升高幅度与辐照剂量成正比。整个贮藏期间，CK组和0.5 kGy辐照组的水溶性Ca含量变化不大，始终在10 mg·100 g-1上下浮动，而1.5 kGy 和2.5 kGy辐照组的水溶性Ca 含量随着贮藏时间的延长而快速下降，逐渐与CK 组接近，再趋于平缓。贮藏30 d 后，2.5 kGy 辐照组蓝莓果实水溶性Ca 含量与0.5 kGy 辐照组和CK 组差异显著。随着贮藏时间的延长，辐照蓝莓果实水溶性Ca可能向其他形态Ca转变，导致其增加量有所下降，这种变化可能与果胶的去甲基程度有关。

图2 不同辐照剂量对冷藏蓝莓果实钙结合形态的影响Fig.2 Effect of different radiation doses on calcium-binding morphology of refrigerated blueberry fruits

由图2-B 可知，辐照处理后（贮藏0 d）各组蓝莓果实NaCl溶性Ca含量略有下降，说明辐照刺激对各组蓝莓果实NaCl 溶性Ca 含量影响不大。随着贮藏时间的延长，CK组和0.5 kGy辐照组NaCl溶性Ca含量缓慢下降，而1.5 kGy 和2.5 kGy 辐照组则先快速升高再趋于平缓。贮藏10～30 d，NaCl溶性Ca 含量表现为2.5 kGy辐照组＞1.5 kGy辐照组＞CK组和0.5 kGy辐照组，说明冷藏期间Ca与果胶的结合有所增加。由此可知，1.5 kGy和2.5 kGy辐照促进了冷藏蓝莓果实NaCl溶性Ca的累积，但累积效果在冷藏后期逐渐减弱。

由图2-C、D可知，HCl溶性Ca和HAc溶性Ca含量的变化比较相似，辐照处理后（贮藏0 d）均有所下降，且下降幅度与辐照剂量呈正比，这与水溶性Ca含量的变化正好相反，说明辐照处理后水溶性Ca含量的增加是由HCl 溶性Ca 和HAc 溶性Ca 含量下降所致。整个贮藏期间，CK 组和0.5 kGy 辐照组的HCl 溶性Ca 和HAc 溶性Ca含量基本保持不变，而1.5 kGy和2.5 kGy辐照组先快速下降，在贮藏10 d达到最低后趋于平缓，该结果与NaCl溶性Ca含量变化相反，说明冷藏期间NaCl溶性Ca 的累积与HCl 溶性Ca 和HAc 溶性Ca 含量下降有关。

2.3 辐照处理对蓝莓果实钙亚细胞分布的影响

如图3-A 所示，辐照处理后（贮藏0 d），冷藏蓝莓果肉细胞壁Ca含量无明显变化，说明辐照处理对细胞壁Ca 含量无直接影响。随着贮藏时间的延长，CK 组和0.5 kGy 辐照组的Ca 含量变化不明显，两者之间差异不显著，说明0.5 kGy 辐照对冷藏蓝莓果肉细胞壁Ca 含量影响不大。但1.5 kGy 和2.5 kGy 辐照组的Ca含量却迅速升高，并在贮藏15 d 时分别达到峰值，之后再缓慢下降，说明1.5 kGy 和2.5 kGy 辐照能够促进贮藏前期Ca在蓝莓果肉细胞壁的积累。贮藏15 d后，2.5 kGy 辐照组的细胞壁Ca 含量最高，1.5 kGy 辐照组次之，且都显著高于CK 组，说明1.5 kGy 和2.5 kGy 辐照处理提高了冷藏后期蓝莓果肉细胞壁的Ca含量。

图3 不同辐照剂量对冷藏蓝莓果实钙亚细胞分布的影响Fig.3 Effect of different radiation doses on calcium subcellular distribution of refrigerated blueberry fruits

各组蓝莓果肉细胞器的Ca含量变化如图3-B所示。CK组细胞器Ca含量在整个贮藏期间变化不大，并始终处于较高水平。辐照处理后（0 d），细胞器Ca含量随辐照剂量的升高而下降，且处理间差异显著（P＜0.05），说明辐照刺激能够促进细胞器Ca的外流，且这种刺激作用与辐照剂量成正比。随着贮藏时间的延长，0.5 kG辐照组的细胞器Ca含量变化与CK 组接近，但1.5 kGy和2.5 kGy 辐照组的细胞器Ca 含量快速下降，在贮藏15 d 达到峰谷后又缓慢升高。整个贮藏期间，细胞器Ca含量表现为2.5 kGy辐照组＜1.5 kGy辐照组＜0.5 kGy辐照组和CK组。综上，1.5 kGy和2.5 kGy辐照处理对冷藏期间蓝莓果肉细胞器Ca的外流有持续效应。

不同地，辐照处理后（贮藏后0 d），蓝莓果肉细胞质Ca 含量却逐渐升高（图3-C），其中1.5 kGy 和2.5 kGy 辐照组的细胞质Ca 含量显著高于CK 组（P＜0.05），说明辐照刺激能够诱导细胞质Ca 含量的升高。随着贮藏时间的延长，0.5 kGy 辐照组细胞器Ca 含量变化不大，且与CK 组基本一致，并始终处于较高水平。但1.5 kGy 和2.5 kGy 辐照组的细胞质Ca 含量却随着贮藏时间的延长而明显下降，直到贮藏15 d 时才趋于平缓，说明1.5 kGy 和2.5 kGy 辐照处理降低了冷藏期间蓝莓果肉细胞质的Ca 含量。该结果与细胞器Ca含量变化的结果相似，但与细胞壁Ca含量变化的结果相反，由此推测，辐照处理后冷藏蓝莓果肉细胞壁Ca可能来自细胞器和细胞质。

2.4 钙形态和亚细胞钙分布与果实硬度的关系

对不同处理组中冷藏蓝莓果实硬度与不同溶解性Ca含量及细胞壁、细胞器和细胞质Ca含量的Pearson相关性进行分析，结果如表1所示。与CK组相比，0.5 kGy辐照组中不同溶解性Ca 含量与果实硬度的相关系数值无明显变化，且两组果实硬度与细胞壁和细胞器Ca含量分别呈正相关，而与细胞质Ca 含量均呈负相关。说明0.5 kGy 辐照处理对果实硬度与钙形态和亚细胞钙分布的关系影响不大。

表1 钙形态和亚细胞钙分布与冷藏蓝莓果实硬度的Pearson相关性Table 1 Pearson correlation between calcium form and subcellular distribution with fruit firmness infrozen blueberries

1.5 kGy辐照处理后，果实硬度与钙形态和亚细胞钙分布的关系发生了明显变化。不同溶解性Ca 含量与果实硬度的相关系数值均有所下降，其中水溶性Ca含量与果实硬度由负相关转为正相关，NaCl溶性Ca含量与果实硬度由正相关转为负相关。同时，细胞壁、细胞器和细胞质Ca 含量与果实硬度的关系也发生了转变，且三者的相关系数值相对较小。说明1.5 kGy 辐照处理减弱了冷藏蓝莓果实硬度与钙形态和亚细胞钙分布间的相关性，其对果实硬度的积极影响可能与其他途径有关。

2.5 kGy 辐照处理后，不同溶解性Ca 含量与果实硬度相关系数值变化不大，但HCl 溶性Ca 含量和HAc溶性Ca含量与果实硬度均由正相关转为负相关，且水溶性Ca 含量与果实硬度的相关性有所增强，说明2.5 kGy 辐照处理对果实硬度的积极影响与水溶Ca 含量、HCl 溶性Ca 含量和HAc 溶性Ca 含量的减少有关。同时，细胞质Ca 含量与果实硬度的关系也发生了转变，且细胞质Ca 含量与果实硬度的相关性明显加强。说明2.5 kGy 辐照处理对冷藏蓝莓果实硬度的积极影响与亚细胞钙分布有关。

3 讨论

果实硬度作为果实的重要性状，与细胞壁的组成和结构密切相关，而钙对果实硬度的保持有着非常重要的作用［20-22］。钙不仅是细胞结构的重要组成，还是传递胞外信号的第二使者［23-26］。植物受到外界刺激后，细胞内Ca2+的平衡状态被打破，释放出的多余Ca2+能够通过静电作用与果胶类大分子配体进行螯合，以结合态钙存在，直接参与细胞壁的修饰，如生物紫外线光暴露和干旱胁迫都增强了植物细胞壁吸收和积累Ca2+的能力［14，27-28］。冷藏期间，辐照蓝莓果肉细胞Ca形态和亚细胞钙分布发生变化，并对果实硬度产生了截然不同的影响。其中，0.5 kGy辐照处理对冷藏蓝莓果肉细胞Ca形态和亚细胞钙分布的影响不大，且上述指标与果实硬度的关系变化也不明显，而1.5 kGy 和2.5 kGy 辐照处理后钙形态和亚细胞钙分布发生了两次不同的变化。第一次变化是辐照处理后（贮藏0 d），表现为HCl 溶性Ca 和HAc 溶性Ca 向水溶性Ca 转变，细胞器Ca2+流入细胞质，这可能与辐照刺激Ca2+信号传递有关。第二次变化是冷藏期间，表现为水溶性Ca向NaCl溶性Ca转变，使细胞壁Ca 含量累积增加，这可能与Ca2+第二信使调控细胞壁多糖降解有关，且2.5 kGy辐照蓝莓果实硬度与钙形态和亚细胞钙分布间的相关性较强。细胞壁上存在大量Ca2+结合位点，果胶占据了大量Ca2+结合位点，果胶的负电荷对Ca2+具有很强的吸引力，与果胶羧基以离子键的方式结合形成“蛋盒”结构，可以维持细胞壁的结构与功能，对果实硬度品质有积极影响［29-32］。前人研究发现，2.5 kGy辐照处理有效抑制了离子型果胶降解和解聚，保持了细胞壁结构稳定，使冷藏蓝莓果实硬度保持较高水平［11］。由此推测，本研究2.5 kGy 辐照很可能介导胞内Ca2+信号，提高了细胞壁对Ca2+的吸附能力，促进Ca2+与果胶酸盐的离子交换，使细胞器释放的多余Ca2+被细胞壁累积，进而抑制中胶层的解体，对冷藏蓝莓果实硬度产生积极的影响。但1.5 kGy 辐照组果实硬度变化与细胞壁Ca 含量升高无关，说明Ca 在细胞壁的积累需要达到一定程度才可能对果实硬度产生有效影响。

4 结论

本研究结果表明，0.5 kGy辐照处理对冷藏蓝莓果实钙的溶解性及其在亚细胞中的分布没有影响，1.5 kGy和2.5 kGy辐照处理能够使蓝莓果实水溶性Ca含量升高，HCl 溶性Ca 和HAc 溶性Ca 含量下降，促进细胞器Ca2+流向细胞质，并在冷藏期间逐渐向NaCl 溶性Ca 转变，被细胞壁吸附且累积，其中1.5 kGy 辐照引起的钙形态和亚细胞钙分布变化与冷藏蓝莓果实硬度无关，但2.5 kGy 辐照处理能够有效促进胞内Ca2+向细胞壁迁移，对冷藏蓝莓果实硬度产生积极影响。