鸟氨酸氨甲酰基转移酶对黄酒贮藏过程中氨基甲酸乙酯的调控及品质变化研究

方若思 夏 婷 林晨琪 周湖淇 肖功年

（1浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江 杭州 310023；2贝因美（杭州）食品研究院有限公司，浙江 杭州 310000）

黄酒是中国传统的发酵酒［1］，其发酵过程主要涉及三个阶段：淀粉的糖化、酵母菌的酒精发酵和乳酸菌的乳酸发酵［2］。虽然黄酒发酵会产生大量氨基酸，营养丰富，但也存在安全问题，尤其是会产生氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）［3］。

EC 是黄酒发酵过程中的副产物，已被证明能引起小鼠肿瘤，因此，国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）将EC 升级为2A，即“可能的人类致癌物”［4］。尿素和瓜氨酸是EC 最主要的前体物［5-6］，一般由精氨酸代谢生成［7-9］，区别在于酵母会降解精氨酸产生尿素［10］，而乳酸菌通过精氨酸脱亚氨基酶（ariginine desiminase，ADI）途径分解精氨酸产生瓜氨酸。在乳酸菌中参与ADI途径的有3种酶：精氨酸脱亚氨基酶（ariginine desiminase，ADI）、鸟氨酸氨甲酰基转移酶 （ornithine transcarbamoylase，OTC）和磷酸激酶（creatinine phosphokinase，CK）［11-12］（图1）。

图1 乳酸菌的精氨酸脱亚胺酶途径Fig.1 ADI pathway of Lactic acid bacteria

目前已报道有多种方法可以抑制EC 的形成［13］，主要分为4 类：物理方法、化学方法、酶学手段及代谢工程途径。物理抑制方法主要包括精炼原材料、优化生产过程及在下游加工过程中过滤发酵产物；化学法主要集中在去除一些化学物质（如氰化物催化剂）以减少EC或前体物含量；酶学手段主要采用酸性脲酶来降解尿素或氨基甲酸乙酯降解酶来直接催化EC降解；代谢工程途径在近年来研究非常广泛，如抑制精氨酸酶基因CAR1的表达，精氨酸酶可以降解精氨酸，形成EC前体物尿素；或增强尿素循环和转运途径中尿素酰胺化酶基因DUR1，2 和尿素转运酶基因DUR3 的表达。酶学手段和代谢工程方法大多围绕尿素开展［14-17］，如添加脲酶，增强尿素代谢途径中的基因表达等，但针对OTC酶的研究却很有限。前期研究表明，OTC 与EC呈负相关［18］。在此基础上，浙江科技学院生物与化学工程学院食品生物技术课题组克隆并突变了9 株产自短乳杆菌（Lactobacillus brevis）的OTC，结果显示，H140A和Q143W的突变位点可以显著提高酶活［19］。本研究进一步构建了H140A和Q143W 双位点突变菌株，探究高酶活突变菌株对黄酒贮藏过程中EC 代谢和黄酒品质变化的影响，旨在为黄酒企业进行EC 阻遏提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

单位点突变菌株H140A-OTC 和Q143W-OTC 已于前期构建［19］并保存于浙江科技学院食品生物技术实验室；精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、茚三酮、异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside，IPTG）、硫酸卡那霉素、Ni-NTA 6FF His标签蛋白纯化试剂盒均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，黄酒购自古越龙山黄酒有限公司，为半干型三年陈黄酒，酒精度≥14% vol，总糖含量为15.1～40.0 g·L-1。

1.2 仪器与设备

SpectraMax iD3 酶标仪，美国Molecular Devices 公司；TS-5000Z 味觉分析系统，日本INSENT 公司；Waters 2695 高效液相色谱仪，美国WATERS 公司；5975c-7890A GC-MS 气质联用分析仪，美国安捷伦公司；L8900 全自动氨基酸分析仪，日本日立公司；APV-2000高压均质机，德国APV公司。

1.3 试验方法

1.3.1 双位点突变菌株H140A-Q143W-OTC 的构建 以单位点突变的菌株Q143W-OTC 为模板，设计引物如下：正向引物5’-GTTTAACTGATGAATGGGCC CCAACATGGATGCTG-3’，反向引物5’-CAGCATCC ATGTTGGGGCCCATTCATCAGTTAAAC-3’（下划线部分为突变的位点），进行PCR 基因扩增，使用限制性核酸内切酶DpnⅠ对PCR反应产物进行消化处理（37 ℃，2 h）Dpn，以消除父本模板；采用热击转化法将克隆产物转入Escherichia coliDH5α 感受态细胞中。突变体质粒经上海生工有限公司测序验证后进一步转化至E.coliBL21（DE3）感受态细胞中，获取目标菌株并进行菌种保藏。

1.3.2 突变菌株与野生菌株OTC 酶的诱导表达及纯化 挑取抗性平板中长出的单菌落接种到5 mL 含100 μg·mL-1卡那霉素的LB 液体培养基中，于37 ℃、200 r·min-1的摇床中培养过夜。取2 mL 菌液接种至200 mL LB 液体培养基中，37 ℃、200 r·min-1培养3～4 h 至OD600达到0.6～0.8，然后加入200 μL IPTG，在25 ℃、180 r·min-1的摇床中诱导培养过夜。于4 ℃、8 000 r·min-1条件下离心30 min，收集菌体，加入30 mL咪唑缓冲液（50 mmol·L-1NaH2PO4，300 mmol·L-1NaCl，20 mmol·L-1咪唑，pH 值8.0） 重悬菌体，随后采用高压均质机破碎细胞（压力为800 bar，进行2 个循环，每个循环为95 s），再次离心（4 ℃、9 000 r·min-1离心30 min）获得上清液，采用Ni-NTA 6FF His 标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。

1.3.3 黄酒样品处理 在黄酒样品中加入相同酶活（10 U·mg-1）的纯化后的OTC酶，样品分为5组，分别为未经任何处理的对照组（CK）和4 个OTC 酶处理组，即LB（来自野生型菌株）、H140A（来自H140 位点突变的菌株）、Q143W（来自Q143 位点突变的菌株）和H140-Q143W（来自H140和Q143双位点突变的菌株）。处理后的黄酒样品在室温下储存40 d。

1.3.4 EC、尿素和瓜氨酸含量的测定 采用Fu 等［20］的高效液相色谱荧光检测法（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）检测EC 浓度，分别基于Fu 等［20］和Boyde 等［21］的方法测定瓜氨酸和尿素含量。

1.3.5 挥发性风味物质及氨基酸含量测定 采用顶空固相微萃取气质联用（headspace solid phase microextraction/gas chromatography/mass spectrometry，HS-SPME-GC/MS）分析黄酒样品的挥发性风味化合物［22-23］，采用氨基酸分析仪检测游离氨基酸的种类及含量。

1.3.6 电子舌味觉分析 采用电子舌（TS-5000Z）进行分析测定［24］。

1.3.7 黄酒样品中的有机酸分析 采用高效液相色谱仪对黄酒中的有机酸含量进行测定［25］。色谱柱为C18 柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm），以 0.05 mol ·L-1pH值2.90 的KH2PO4作为流动相，柱温30 ℃，流速0.8 mL·min-1，进样量5 μL，紫外检测器波长为215 nm。酒样经离心过滤后直接进样。

1.4 数据统计分析

每个试验重复3 次，采用SPSS 软件进行差异显著性分析，Origin 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 OTC酶对黄酒不同贮藏时间下EC含量的影响

由图2 可知，双位点突变组H140A-Q143W 的EC含量在整个贮藏期间均明显低于对照组，并在40 d 后持续下降。H140A 和Q143W 突变组的EC 含量除贮藏5 和30 d 外均低于对照组。野生OTC 酶尽管在前30 d能够抑制EC，但随着贮藏时间的延长，EC 水平也随之升高。总体而言，突变OTC酶可以抑制贮藏过程中EC的形成，且浓度最多可降解20%。

图2 OTC酶对黄酒不同贮藏时间下EC含量的影响Fig.2 Effects of OTC on EC metabolism of yellow rice wine under different storage time

2.2 OTC 酶对黄酒不同贮藏时间下尿素和瓜氨酸含量的影响

由图3-A 可知，对照组发酵液中的尿素含量整体低于所有OTC酶试验组，这意味着胞内被利用形成EC的尿素含量较高，从而刺激了EC的产生。这一变化规律与图2相符，也与前人报道一致［14］。此外，双突变组H140A-Q143W 的尿素和瓜氨酸含量相对于其他各组均明显升高，而单突变H140A和Q143W 组仅略高于对照组（图3）。

图3 黄酒贮藏过程中不同处理组尿素和瓜氨酸含量的变化规律Fig.3 Changes of urea and citrulline contents in different treatment groups during yellow rice wine storage

2.3 黄酒不同贮藏时间下挥发性风味物质和氨基酸的变化规律研究

黄酒含有多种生物活性成分，尤其是氨基酸。麦曲中蛋白质水解会产生大量氨基酸，它们可作为高级醇、醛和其他风味化合物的前体，同时，未消耗的氨基酸又可为黄酒提供绵厚的口味。图4 显示了不同处理组在40 d贮藏期的氨基酸含量变化。野生型（LB组）总氨基酸含量最高，其次是Q143W、H140A、Q143WH140A 和对照组。表明黄酒中加入OTC 可以促进氨基酸的形成，以未突变的促进效果最好。

图4 黄酒贮藏过程中不同处理组游离氨基酸的变化规律Fig.4 Changes of amino acids in different treatment groups during yellow rice wine storage

挥发性风味物质是影响黄酒感观和质量的最重要因素［26］。陈酿过程可以促进酸与醇缩合形成酯，从而改善黄酒的风味特征［23，26］。表1 列出了贮藏40 d 后不同处理组的主要风味物质相对含量，图5-A较直观地进行了阐明。如图5-B所示，酸、酯、醇和醛为主导风味。占风味物质近一半的醇类分别为乙醇、苯乙醇、2，3-丁二醇、异戊醇和异丙醇。H140A-Q143W 组的酒精含量最低。酯类主要构成与黄酒相关的果味和香气［27］。自然发酵组、对照组和突变组酯类含量相差不大。黄酒中主要的酯类有己酸乙酯、苯甲酸乙酯、琥珀酸乙酯、棕榈酸乙酯和苯乙酸乙酯。添加OTC 酶后，主要醛类如糠醛和苯甲醛含量有所增加。HS-SPME-GC/MS 共检测出3 种挥发性酸，其中乙酸是主要的酸类物质。H140A-Q143W组酸度最高。

表1 黄酒样品中不同处理组的挥发性风味物质相对含量Table 1 The relative content of volatile flavor compounds in different treatments of yellow rice wine/%

图5 不同样品的挥发性风味物质的比较分析Fig.5 Comparative analysis of volatile flavor compounds in different samples

主成分分析（primary component analysis，PCA）的目标是根据数据的差异和相似性来解释数据，以便更好地可视化所有信息［28］。本研究对挥发性风味物质进行PCA 分析，得到3 个主成分，如图5-C 所示。PC1和PC2 分别占51.3%和31.0%。同时，为表征显著信号，计算了偏最小二乘回归-判别分析 （partial least squares discriminant analysis，PLS-DA） 模型的投影变量重要性 （variable importance in projection，VIP） 分数。VIP 分数［29］是一个用于说明特定实验变量在分类模型定义中相对重要性的指标。VIP＞1 的MS 信号通常被认为是重要信号［30］。如图5-D 所示，在黄酒样品中，标志性风味物质是乙醇、异戊醇和异丙醇。总体而言，OTC 酶的添加对黄酒样品的挥发性风味化合物具有潜在影响。双位点突变组与其他组有明显差异，而H140A组与对照组最为相似。

2.4 味觉分析

味觉是影响食品感官和质量的另一个关键因素，如今电子舌在食品工业已有广泛应用［31-32］。图6的雷达图显示了黄酒不同处理组的味觉分析结果。曲线的重叠意味着除Q143W 组外，其他各组整体味觉无明显差异，表明单位点突变组Q143W 可能对黄酒的味道有影响。

图6 黄酒味觉的雷达图Fig.6 Radar plot of yellow rice wine taste

2.5 有机酸分析

酸是黄酒酒体的重要组成部分，适量的酸在酒中能起到调节风味的作用，并在贮存过程中与醇类物质作用逐渐形成芳香酯。此外，酸不仅能使黄酒酒体协调，还能增强黄酒的醇厚感。本研究在黄酒样品中检测了几种重要的有机酸含量，结果如图7 所示。总有机酸含量范围在47～116 g·L-1之间，其中乙酸是最主要的有机酸，含量为21～54 g·L-1，约占总量的一半。与对照组相比，H140A组有机酸含量明显增加，双位点突变组Q143W-H140A 与其几乎相同，而LB 降低了总有机酸含量。

图7 不同黄酒样品中的有机酸含量Fig.7 Total organic acids contents in different yellow rice wine samples

3 讨论

目前关于OTC 酶的研究较少，主要集中在人体内，由于它是肝脏尿素循环的必需酶，因此OTC 酶的缺失常导致嗜睡、呕吐、精神发育迟缓等症状，同时OTC的缺失与否也可作为肝细胞癌的早期诊断指标之一［33-34］。然而OTC 与EC 的直接关联性未见任何研究报道。作者前期研究发现，在发酵中期添加OTC 酶能明显降低EC 含量，表明OTC 酶有望应用于黄酒的酿造生产；同时，基于来自短乳杆菌OTC 的氨基酸序列，使用Discovery Studio 软件构建突变文库，发现Q143W和H140A 突变体的催化活性比野生型高2～3 倍且表现出优异的乙醇耐受性，为应用于黄酒发酵提供了新的可能性。本研究在前期基础上，更进一步探究了突变后的OTC 酶对EC 代谢及贮藏期黄酒品质变化的影响。

目前对如脲酶、氨基甲酸乙酯水解酶的相关酶类研究已有报道，前人通过突变文库的构建和位点的突变改造发现OTC 对黄酒中的EC 有一定去除作用，且去除率最高可达16%［35-36］，而本研究将OTC 酶定点突变改造后，对贮藏期的黄酒EC 含量抑制效果明显，最高可达20%，且对黄酒的理化品质影响不大，证明本试验方法可行。

传统酿造黄酒是我国重要的微生物发酵饮品，独特的微生态发酵体系和复杂的生物化学反应导致其加工品质与安全调控成为黄酒酿造中面临的主要科学难题。本研究从酶学角度出发，对影响EC代谢的乳酸菌精氨酸代谢关键酶OTC 进行定点突变改造并应用于黄酒体系，探究其对EC代谢及贮藏期黄酒品质变化的影响，具有一定创新性，且酶学手段与其他抑制方法相比具有明显优势，如无需特殊加工处理和额外添加化学物质，也未引入未知安全性的菌株，工业应用性强。但同时也存在一定局限性，如尽管未直接在酒体中添加突变菌株，但酶是从突变菌株中分离纯化得到，是否存在安全隐患；同时酶的性质较不稳定，易受外界影响而降解失去活性，如何保障酶在黄酒发酵及贮藏期间保持活性均是后续工作需要进一步解决的问题。

4 结论

本研究对鸟氨酸转氨甲酰酶在黄酒贮藏过程中对氨基甲酸乙酯的调控和黄酒品质变化进行了初步探究，发现突变的OTC 酶可以抑制贮藏过程中EC 的形成，其中双位点突变组H140A-Q143W 的抑制作用尤为明显，EC 含量最多可降解20%，且在氨基酸、味觉、有机酸等方面也与对照最为接近。这为抑制黄酒发酵过程中EC的形成提供了一种新方法。