基于激光促释固相微萃取分析乌鳢不同部位挥发性成分

宋恭帅 王丹丽 袁婷兰 李 玲 龚金炎

（浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江 杭州 310023）

乌鳢（Channa argus），俗称黑鱼、乌鱼等，鲈形目鳢科鳢属。乌鳢体色呈黑色，体侧有不规则黑斑，广泛分布于我国各大水系，是常见的淡水食用鱼［1］。乌鳢营养丰富，含有人体所需的钙、铁等微量元素，且蛋白、脂肪含量高，具有较高的药用和食用价值［1-2］。乌鳢因刺少、采肉率高且肉质细嫩鲜美而深受消费者喜爱，具有滋补调养、祛风治疳、生肌补血、促进伤口愈合等功效［3-4］。吴小东［5］研究发现，乌鳢鱼胆中的牛黄胆酸钠和牛黄鹅去氧胆酸钠具有一定的抗炎活性。周朝伟等［6］通过对乌鳢进行营养成分分析，证明了其具有较高的营养价值。但作为一种经济鱼类，乌鳢各个部位在实际生产开发中均会产生不同程度的腥臭味，影响了其利用价值。

国内外对于乌鳢不同部位挥发性成分的研究较少，相关研究主要集中于鱼肉保鲜［1，7］和高效养殖技术［8］方面。户帅锋等［7］以壳聚糖、山梨酸-壳聚糖微囊粉末及山梨酸为抗菌物质，制备出复合抗菌薄膜，延长了乌鳢货架期。马文慧等［4］分析测定了乌鳢鱼片在贮藏过程中的品质变化，发现低温处理能减缓冻藏过程中蛋白质和脂质劣变。吴红霞［8］从多方面探讨了乌鳢的养殖条件，发现与传统养殖技术相比，综合养殖技术的应用使乌鳢增产增效达30%。乌鳢不同部位挥发性成分会影响其利用价值，故需研究各部位挥发性成分的差异。

挥发性成分的分析包括成分收集与分析，目前较为常用的收集方法是顶空固相微萃取法（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）［9］。然而传统的HS-SPME 主要采用热辅助解吸（heat assisted desorption，HAD），存在萃取时间较长、萃取头使用寿命短等问题［10］。激光作为一种高质量的光源，因具有较好的方向性、单色性、相干性及亮度等特性而被广泛应用于科学研究［11］。激光可有效促进样品中挥发性成分的快速释放，极大缩短了挥发性物质的释放时间，从而有效提高了挥发性成分的萃取效率［12-13］。Song 等［12-13］建立了一种新型的激光照射解吸（laser irradiation desorption，LID）技术以取代HAD，使样品中挥发性成分在较短时间内获得释放，整个分析过程高效、简便且成本较低。因此，本研究采用新型的LID技术进行解吸，并进一步通过顶空固相微萃取-气质联用技术（headspace solid phase microextraction gas chromatography mass spectrometry，HS-SPME-GC/MS）分析鉴定乌鳢不同部位的挥发性成分，根据数理统计得到区分不同部位的重要成分，旨在为乌鳢的腥味研究和有效利用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

乌鳢，由浙江省水产质量检测中心提供。

1.2 仪器与设备

Thermo Trace DSQ Ⅱ 气相色谱与质谱联用仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司；二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷涂层萃取头（50/30 μm），美国Supelco 公司；二极管激光器（最大允许输出功率为50 W，最长工作波长为450 nm），长春镭仕光电科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备 用220 V 的电压将3 条体长（约25 cm）、体重（约2 000 g）大致相同的鲜活乌鳢电击至晕，用刀取内脏和鳃，剥皮、取肉。分别从3条乌鳢身上各取内脏、鳃、肌肉和皮肤10 g 分装入顶空瓶中，置于-4 ℃冰箱冷藏备用。

1.3.2 感官评定 随机选取20 名经过相关培训的评估人员（男女性人数相同）对不同部位的乌鳢样品进行感官评价。根据样品特性确定5 种感官指标，包括油脂味、青草味、坚果味、土腥味和鱼腥味，并根据气味强弱进行打分评定［12］。评分标准从很弱（-2 分）依次递增至很强，共五个等级（-2、-1、0、1、2）。

1.3.3 顶空固相微萃取条件 将老化好的萃取头插入进样瓶顶空部分约2 mm，萃取温度约50 ℃，待吸附完成后，取出萃取头并立即插入GC 进样口，于250 ℃条件下解吸3 min。

利用二极管激光器对乌鳢样品进行照射，并分析激光照射功率、样品添加量与照射时间3 个单因素对乌鳢样品中挥发性风味物质萃取效果的影响。

1.3.4 GC/MS 检测条件 GC 条件：HP-88 毛细管色谱柱（30 m × 0.25 mm，0.20 μm）；不分流进样；进样口温度：250 ℃；载气：高纯氦气；升温程序：起始柱温70 ℃，保持1 min，以4 ℃·min-1的速度升至180 ℃，保持5 min；再以3 ℃·min-1的速度升至230 ℃，保持5 min。

MS 条件：电子离子源温度200 ℃；检测器温度280 ℃；传输线温度250 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z30～500。

1.3.5 化合物定性分析 选取常见的己醛、1-戊烯-3-醇、壬醛等10 种标准品，基于保留指数和特征离子碎片等进行乌鳢样品中挥发性成分的定性分析，剩余挥发性成分则通过相关谱库（FFNSC1.3、NIST11s和NIST11）进行相似度检索，并以正构烷烃的保留指数为基准，计算剩余挥发性成分的保留指数［14-16］。

1.4 数据处理

每组样品重复测试3 次，所有试验数据均以平均值±标准偏差表示，并采用SPSS 21.0 软件对数据进行显著性分析。采用SIMCA 14.1 软件对数据进行化学计量统计。

2 结果与分析

2.1 感官评定结果

图1 为乌鳢内脏、肌肉、皮及鳃4 个不同部位的特征气味差异雷达图。结果表明，乌鳢不同部位的气味差异较为明显。肌肉与鳃中鱼腥味、油脂味和土腥味最强，这可能与乌鳢生活的环境有关。此外，在4 个部位中都含有较强的土腥味，这可能是由于乌鳢通过食物链摄入附有含土腥味细菌的蓝藻、硅藻等浮游生物及部分水草。相比之下，内脏和皮中油脂味最弱，主要是由于这两个部位的组织结构较为紧密，导致游离脂质的含量较少。

图1 乌鳢不同部位感官评分雷达图Fig.1 The radar chart of organoleptic scores for different parts of snakehead

2.2 激光照射条件对挥发性物质萃取效果的影响

激光能量的强弱与其照射功率的大小有关［14］。如图2-A 所示，随着照射功率的升高，己醛、己醇、1-辛烯-3-醇和壬醛的峰面积均呈现先增大后减小的趋势，当照射功率为10 W 时，4 种特征挥发性成分的峰面积最大，说明该条件下的萃取效果最佳。功率过低时，内脏表面的温度较低，其挥发性成分不能完全挥发出来；功率过高时，导致表面温度过高，易使内脏发生化学变化而产生新的挥发性物质，故选择10 W 为最佳激光照射功率。

图2 照射功率（A）、样品添加量（B）及照射时间（C）对挥发性成分萃取率的影响Fig.2 Effect of irradiation power （A），sample volume （B） and irradiation time （C） on the extraction efficiency of the selected characteristic compounds

在相同照射功率下，样品添加量越大，升温速率越慢，从而导致挥发性成分不易挥发。由图2-B可知，在添加量为2～3 g时，样品中挥发性成分的峰面积均随添加量的增加而增大，添加量为3 g 时，各物质峰面积最大。之后，随着样品添加量的增加，各物质的峰面积均逐渐减小。因此，最佳样品添加量为3 g。

在相同激光照射功率及样品添加量下，照射时间越长，温度变化越明显。由图2-C 可知，4 种特征挥发性物质的峰面积受照射时间影响较大。在3～5 min时，峰面积均随照射时间的延长而增大，5 min 时各物质峰面积达到最大值，故选择5 min 为最佳照射时间。

2.3 乌鳢不同部位挥发性成分分析

采用LID-HS-SPME-GC/MS 分别对乌鳢的内脏、鳃、肌肉和皮4 个部位进行挥发性成分的测定和分析，结果如表1 所示。4 个样品中共检出40 种挥发性成分，包括醛类13种、醇类7种、酮类2种、烃类7种、酯类2 种以及其他类9 种，其中17 种成分为4 个部位共有。由表1 还可以看出，乌鳢不同部位挥发性成分的种类和含量均有明显差异。

表1 乌鳢内脏、肌肉、皮和鳃的挥发性成分Table 1 Volatile components of viscera，muscles，skin and gills of snakehead

醛类物质主要来源于不饱和脂肪酸的分解，感觉阈值相比其他物质低，即使微量也会对整体的气味产生一定的影响，具有脂肪味、鱼腥味、青草味等［17］。乌鳢体内共检出13 种醛类物质，其中内脏10 种、肌肉10 种、皮9 种、鳃9 种。己醛和壬醛是含量最高的两种物质，分别贡献鱼腥味、青草味和脂肪味、鱼腥味、清香味，是乌鳢体内腥味的主要来源。己醛在肌肉中含量最高，为15.45 μg·kg-1；而壬醛在皮中的含量最高，为18.52 μg·kg-1，内脏中最低，仅为0.83 μg·kg-1。4 个部位中，肌肉和皮的醛类物质总含量较高，分别为33.64 和37.55 μg·kg-1，说明醛类对肌肉和皮气味形成影响较大，可能是其腥臭味的主要来源［18-19］。

醇类物质一般由羰基化合物还原产生，可分为饱和醇与不饱和醇。不饱和醇的感觉阈值更低，对整体气味的影响更大［20-21］。乌鳢体内共检出7 种醇类物质，其中1-辛烯-3-醇是共有且含量最高的物质，在内脏、肌肉、皮、鳃中的相对含量分别为5.58、9.65、7.84、17.36 μg·kg-1，具有令人不愉快的土腥味；且醇类物质在鳃中的总含量最高（24.90 μg·kg-1），对鳃气味的形成影响较大。土腥味是影响乌鳢口感的一个关键因素，而醇类物质是水产品中泥土味或者类似金属味的主要来源［22-24］。

烃类物质在乌鳢体内检出量较低但种类丰富，共有7种，其中乙苯、对二甲苯和2，6，10-三甲基-十六烷为4 个部位所共有。烃类主要是由脂肪酸烷基自由基的均裂产生，普遍阈值高，对乌鳢腥味的直接贡献不大。但烯烃类在一些特定条件下会形成酮、醛，因此对大乌鳢腥味存在潜在影响［25］。另外，酮类、酯类物质种类少且相对含量较低，对整体的气味影响不大。其他类中有几种胺类物质，一般来说具有臭味，对乌鳢腥味特征的形成有一定贡献［26］。

2.4 主成分分析

主成分分析（PCA）是多变量数据分析常用的方法，目的是了解观测变量之间的相似性或差异性，为进一步分析提供参考［27-28］。本研究利用SIMCA 14.1 软件进行PCA，对乌鳢4 个部位的共计40 种挥发性成分进行数据转换和降维，取2个主成分，得到二维平面图如图3-A 所示（J 表示肌肉、N 表示内脏、P 表示皮、S 表示鳃）。第1主成分对解释变量的贡献最大，贡献率为47.80%，第2主成分的贡献率为27.70%。拟合度（R2）和预测能力（Q2）可用来评价模型的有效性［29］。通过计算可知，该模型的R2为92.30%，Q2为89.20%（大于50%），说明其具有良好的可靠性和预测性。36个乌鳢样品被分为统计学意义的集群，即肌肉、内脏、皮和鳃，分布在不同区域。肌肉、内脏和其他两个样品明显区分开，皮和鳃之间的距离相对较近，说明乌鳢不同部位的检测变量（挥发性成分）存在一定差异性，而四组观测变量之间的距离也反映了观测变量或检测变量的差异和相似程度。

图3 多元统计分析Fig.3 Multivariate statistical analysis

图3-B 为主成分载荷散点图，在置信区间为95%的情况下，第1主成分中甲氧基苯肟、3，5，5-三甲基-2-己烯、苯甲醛、3-甲硫基-丙醛等挥发性成分所占比重较大，说明这些变量对于形成第1主成分的贡献较大，结合表1表明这些物质在区分样品中起到重要作用；同理，第2 主成分中4-甲基-5-癸醇、2-戊基呋喃、十二醛、己醛、戊醛等挥发性成分作用较大。PCA 距离图（DModX）表示训练集中的一个观测值到模型平面或超平面的距离，与观测值的剩余标准差成正比。DModX临界值是由F分布计算而来，若观测值是临界值的2倍或以上，则认为是异常值。由图3-C可知，本试验所有观测值均在临界值以下，说明模型中数据有效可靠，不存在异常值，可进行正交偏最小二乘判别分析。

2.5 正交偏最小二乘判别分析

为确定乌鳢不同部位的特征气味物质，本研究在PCA 基础上进一步进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。OPLS-DA 是不同于PCA 的一种有监督作用的判别分析统计方法，与偏最小二乘判别分析（partial least-square discriminant analysis，PLS-DA）相比，OPLS-DA 观测变量矩阵中与预测变量矩阵中无关联的“噪音”变量会被滤除，可更好地解释观测值并有效实现对相应变量的预测［30-31］。

对乌鳢4 个不同部位的36 个观测变量和40 个检测变量进行OPLS-DA 分析，累计R2X为95.50%，累计R2Y为97.80%，均接近于100%，且累计Q2为97.40%（大于50%），说明模型的拟合度和预测性较好。变量重要性投影值（variable importance for the projection，VIP）图可总结各个变量的重要程度，一般地，VIP 值大于1的变量称为重要变量，而小于0.5的则为不重要变量，介于1 和0.5 之间的为灰色区域［32］。图3-D 中将各个变量的VIP 值从大到小进行了排列，共有7 个变量的VIP 值≥1，分别为壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇、正己酸乙烯基酯、2-（氮杂环丙烷-1-基）乙胺、辛醛、3，5，5-三甲基-2-己烯。壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇是排列前三的挥发性成分，与表1中的分析结果一致，说明这3 种物质是判别乌鳢不同部位的重要特征气味物质，贡献了鱼腥味、青草味、脂肪味、油腻味、土腥味、蘑菇味等气味特征，是乌鳢腥臭味的主要来源。

3 讨论

水产动物中腥味物质的组成较为复杂，同一种原料不同部位的腥味组成会存在差异。本研究表明，乌鳢鱼皮中腥味物质最多，而肌肉中相对较少，主要与鱼类自身结构及生活环境有关，这与王国超等［33］报道的结果相一致。脂肪含量较高的鱼体中往往含有更多的腥味物质，这是由于脂肪分解后易产生酮、醛类等挥发性物质。而脂肪分解所需的酶类及微生物更多地存在于鱼皮及内脏中。淡水鱼中含有较强的土臭味与泥土味，此外，水体中的某些藻类及放线菌又会加重鱼体中的腥味。而这些腥味物质往往是先进入鱼体内脏，再进入肌肉组织中。

目前，水产动物中腥味物质的评价方法主要包括感官评价及仪器检测分析。感官评定是最方便、最直接的方法，但一般需要专业的感官评定者完成，其结果存在一定的主观性。仪器检测分析方法则是利用前处理技术与色谱质谱技术相结合来实现对样品中挥发性成分的分析，其中HS-SPME-GC/MS 技术是最为常用的仪器分析方法。作者前期利用传统的HS-SPMEGC/MS 测定了5 种不同提取方法制备的甲鱼油中的挥发性成分，结果表明，需在60 ℃条件下吸附30 min，前处理时间较长［17］。而本试验采用激光照射促释技术仅需5 min，且离子强度相差不大，证明新型激光促释技术结合固相微萃取能快速有效地测定乌鳢不同部位的挥发性成分。后续研究可尝试将该技术应用于更多不同的样品中。

4 结论

乌鳢4 个部位的挥发性成分种类和含量都有明显不同，尤其是呈现鱼腥味、土腥味的壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇在4 个部位的含量差异较大。PCA 发现，4 个部位能明显区分开，且模型中的数据有效可靠，没有异常值，并证明了4 种样品间有明显差异；OPLS-DA 确定了壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇为判别4 个部位最主要的气味物质，贡献了鱼腥味、青草味、脂肪味、油腻味、土腥味、蘑菇味等，是乌鳢特征气味的主要来源。