一株蛋鸡血清8b型禽腺病毒的分离鉴定

路晓 武景琦 张帆 韩易航 牟建青 梁贤 王芸 曹兵 于可响 宋敏训

摘 要：从山东潍坊地区以包涵体肝炎为病变特征的发病蛋鸡中采集病料，通过接种7日龄SPF鸡胚分离到1株病毒，经PCR检测、测序分析、进化树分析和血清中和试验鉴定，确定为血清8b型禽腺病毒。将该病毒通过肌肉注射接种14日龄SPF鸡，结果仅部分试验鸡出现肝脏轻微坏死变性，这与临床中发病鸡肝脏明显坏死甚至破裂并不相符，分析可能与饲养条件、管理水平、鸡的品种和日龄、药物使用等方面有关。

关键词：蛋鸡；血清8b型禽腺病毒；包涵体肝炎；分离鉴定

中图分类号：S858.312.65文献标识码：B文章编号：1673-1085（2023）03-0001-05

鸡包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis in chicken，IBH）是由Ⅰ群禽腺病毒引起鸡的急性传染病，是我国养鸡业中的一种常见病和多发病。根据抗原性差异，Ⅰ群禽腺病毒可分为12个血清型，能引起包涵体肝炎、心包积液、肌胃糜烂等病变[1-3]。其中，血清4型（FAdV-4）病毒主要引起心包积液-肝炎综合征，血清8a型（FAdV-8a）、8b型（FAdV-8b）和11型（FAdV-11）病毒仅导致包涵体肝炎，无心包积液现象[4-7]。鸡包涵体肝炎多发于2～5周龄的鸡群，主要症状是鸡群死亡率突然增加，发病率可达到10%～20%，但死亡率较低，一般不超过5%，通常发病后5～7 d又恢复正常。患病鸡主要表现为精神沉郁、食欲不振、嗜睡、鸡冠发白、羽毛杂乱等症状，剖检可见以肝脏发黄变脆、肿大出血等为主要病变特征的包涵体肝炎，较少出现心包积液，部分肾脏肿大，呈淡黄色，脾脏也伴有肿大，骨髓呈淡红色至淡黄色，最显著的病理变化是肝细胞核内有包涵体[8-9]。近几年来该病在我国鸡群中流行有上升的趋势。

本研究于2022年从山东潍坊地区28周龄有包涵体肝炎病变的产蛋鸡中分离到一株病毒，通过PCR检测、测序分析、进化树分析和血清中和试验鉴定为血清8b型禽腺病毒，通过回归试验确定该病毒为致病病原。

1 材料与方法

1.1 发病情况

山东潍坊地区一家规模化蛋鸡养殖场，28周龄产蛋鸡出现采食下降，死淘率上升，产蛋下降等症状。剖检死亡鸡发现，肝脏坏死变性、部分破裂，胆囊肿大，取病变肝脏用于病原分离。

1.2 材料和试剂

SPF鸡胚和SPF鸡购自山东昊泰动物繁育有限公司。

血清1型、4型、8a型、8b型和11型禽腺病毒阳性血清由本实验室制备和保存。

DNA/RNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自AXYGEN公司；一步法RT-PCR试剂盒、PCR Mix、pMD18-T载体、受感态细胞DH5ɑ购自北京全式金公司。

1.3 病料检测

按照常规方法提取肝脏病料的DNA和RNA，利用PCR或RT-PCR方法进行Ⅰ群禽腺病毒病（FA）、禽流感（AI）、新城疫（ND）、傳染性支气管炎（IB）、传染性法氏囊炎（IBD）、传染性喉气管炎（ILT）、网状内皮增殖症（RE）、禽白血病（AL）、传染性贫血病（CIA）等9种常见病毒病的检测。

1.4 病毒分离

取发病鸡的肝脏，加入5倍体积生理盐水和终浓度1 000 U/mL的卡那霉素，剪碎后充分研磨，然后反复冻融2次，8 000 g离心10 min，取上清用0.22 μm滤器过滤除菌，菌检无菌后经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚，0.1 mL/枚，共6枚。收集接种后3～8 d死亡鸡胚，观察死胚的病变情况，并将尿囊液和胚体混合处理，标记为WF22。

1.5 病毒鉴定

1.5.1 PCR扩增与测序鉴定 按照常规方法提取病毒的DNA，利用PCR方法对Ⅰ群禽腺病毒进行检测。引物参照GenBank发表的Ⅰ群禽腺病毒保守序列进行设计，序列如下：P1：5'  CAARTTCA GRCAGACGGT  3'；P2：5'  GGCTTGACGTACGC TCCGTA  3'，预期扩增片段大小约550 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司（青岛）合成。取5 ?L扩增产物在1.5%琼脂糖中电泳进行检验。按照DNA凝胶回收试剂盒说明回收PCR产物，与pMD18-T载体连接后，转化DH5ɑ。挑单菌落扩大培养并提取质粒进行PCR鉴定，鉴定为阳性的菌落送北京擎科生物科技有限公司（青岛）进行测序。

1.5.2 Hexon基因测序分析 根据GenBank发表的血清8b型禽腺病毒主要抗原Hexon基因序列设计扩增引物，序列如下：P3：5'  CGCCGCATGTG CTACTAG  3'；P4：5'  GGTGAGGATCGAGGAAC C  3'，预期扩增片段大小约3 138 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司（青岛）合成。提取病毒的DNA，利用上述引物进行PCR扩增，将扩增产物回收后送北京擎科生物科技有限公司（青岛）进行测序。利用MEGA软件与GenBank中不同血清型Ⅰ群禽腺病毒的Hexon基因序列进行比对，并绘制进化树。

1.5.3 血清型鉴定 按照常规血清中和试验方法[7]，利用血清1型、4型、8a型、8b型和11型禽腺病毒阳性血清对分离到的病毒进行血清型鉴定。

1.6 SPF鸡回归试验

将WF22株病毒原液采用腿部肌肉注射的方式接种14日龄SPF鸡10只，0.2 mL/只，同时设对照组5只，每只注射生理盐水0.2 mL，观察并记录试验鸡发病、死亡与病变情况，攻毒后第7天剖杀所有试验鸡，观察内脏病变。

采集试验鸡有病变的肝脏，处理后接种7日龄SPF鸡胚5枚，观察鸡胚死亡及病变情况，以确定是否能从实验鸡体内再次分离到病毒。

2 结果与分析

2.1 病料检测

对收集的肝脏病料进行9种鸡常见病毒病的检测，结果显示，只有Ⅰ群禽腺病毒为阳性，其它8种病毒均为阴性（图1）。

2.2 病毒分离

将肝脏病料处理后接种7日龄SPF鸡胚，鸡胚大多在接种后5～8 d内死亡，胚体通身出血，胚肝有黄白色坏死灶（图2）。

2.3 病毒鉴定

2.3.1 PCR扩增与测序鉴定 利用Ⅰ群禽腺病毒通用引物对鸡胚分离毒进行PCR检测，结果为阳性。将扩增产物克隆后进行测序，通过比对发现，该序列与血清8b型禽腺病毒基因同源性最高，在99.9％以上。

2.3.2 Hexon基因测序分析 利用设计好的引物对WF22株的Hexon基因进行扩增测序，利用MEGA软件将其与GenBank登录的Ⅰ群禽腺病毒的Hexon基因序列进行比对，并绘制了进化树（图3），结果发现，WF22株与血清8b型禽腺病毒的遗传关系最近。

2.3.3 血清型鉴定 利用血清1型、4型、8a型、8b型和11型禽腺病毒阳性血清对WF22分离株进行血清型鉴定，结果表明该分离株能被8b型阳性血清完全中和，被8a型阳性血清部分中和，不能被1型、4型和11型阳性血清中和。

2.4 SPF鸡回归试验

将WF22株病毒接种14日龄SPF鸡，攻毒后7 d内试验鸡未出现明显症状，饮水采食基本正常，第7天剖杀所有试验鸡，结果显示，攻毒组4/10出现肝脏肿胀、轻微出血坏死等病变（图4），其它组织无病变，而对照组鸡肝脏均无病变。

取有病变的肝脏处理后接种SPF鸡胚，结果有4枚鸡胚在8 d内死亡，死亡鸡胚均出现胚体出血，病变与病毒初次分离时一致，说明能从回归的试验鸡体内重新分离到病毒。

3 讨论

近十多年来，鸡包涵体肝炎在山东地区一直呈散发性流行[10]，该病病程较短，死亡率一般不会超过5%，由Ⅰ群血清2型、8a型、8b型和11型禽腺病毒引起，主要发生在快大型肉鸡，817肉鸡、蛋鸡、麻鸡等发病较少。自2015年开始，我国大部分养鸡地区发生了一种死亡快、死亡率高、以心包积液和肝脏肿大、质脆、出血或坏死为主要剖检病变特征的传染病，称为肝炎-心包积液综合征，又称安卡拉病；该病死亡率可达50%以上，是由Ⅰ群血清4型禽腺病毒引起，各品种的鸡均可发病。鸡包涵体肝炎和肝炎-心包积液综合征，这两种疾病在血清型、死亡率、病变特征、流行特点等方面存在较大的差别[11-13]。

本研究从山东潍坊地区产蛋下降的蛋鸡中分离到一株病毒，该病毒通过卵黄囊接种SPF鸡胚，引起胚体出血，通过PCR检测、测序分析、进化树分析和血清中和试验鉴定为血清8b型禽腺病毒。将该病毒回归SPF鸡，试验鸡未出现明显症状，部分鸡肝脏仅出现轻微肿胀、出血、坏死，这与临床中发病鸡采食下降、产蛋下降、羽毛杂乱、肝脏明显坏死甚至破裂并不相符，分析可能与饲养条件、管理水平、鸡的品种和日龄、药物使用等方面有关。

参考文献：

[1] Y. M. Saif. 苏敬良，高福，索勋主译. 禽病学[M].北京：中国农业出版社，2005.

[2] Domanska-Blicharz K， Tomczyk G， Smietankak， et al. Molecular characterization of fowl adenoviruses isolated from chickens with gizzard erosions [J]. Poult sci， 2011， 90（5）：983-989.

[3] Monreal G. Adenoviruses and adeno-associated viruses of poultry [J]. Poultry Sci. Rev，1992， 4： 1-27.

[4] 林婷婷，张翔，朱伟民，等. 我国Ⅰ群禽腺病毒流行趋势和防控要点[J]. 家禽科学，2021（09）： 17-19.

[5] 宋佳诚，侯力丹，吴应凯，等. 鸡腺病毒12个血清型代表毒株Penton蛋白基因分型[J]. 中国畜牧兽医，2020，47（11）：3417-3426.

[6] 宋文平，李雪峰，秦亚萍，等. 鸡腺病毒血清4型Hexon蛋白的表达及与不同血清型抗体的交叉反应性评价[J]. 中国兽医科学，2020，50（06）： 679-688.

[7] 秦亚萍，刘亮亮，刘胜旺，等. 鸡腺病毒血清4型和11型Penton蛋白的表达及交叉反应性评价[J]. 中国兽医科学，2022，52（06）：704-711.

[8] 王婉，王彥红，刘伊，等. 鸡包涵体肝炎病原检测及病理学观察[J]. 畜牧兽医学报，2015，46（02）：273-278.

[9] 秦玉华. 鸡腺病毒感染的流行病学调查[J]. 中国动物保健，2022，24（03）：58-59.

[10] 李海英，尹燕博，郭妍妍，等. 12株肉仔鸡包涵体肝炎病毒的分离和PCR鉴定[J]. 中国兽医科学，2010，40（07）：722-727.

[11] 梁广成，高巍，谢泉，等. 一株高致病性血清4型禽腺病毒的分离与鉴定[J]. 中国家禽，2016，38（19）：25-28.

[12] 于可响，黄兵，凌红丽，等. 山东省血清4型禽腺病毒的分离鉴定[J]. 中国动物传染病学报，2016，24（05）：1-5.

[13] 汪凯，蔡骁垚，叶建强，等. 新型鸡心包炎-包涵体肝炎病毒的分离及鉴定[J].中国动物传染病学报，2016，24（04）：1-6.

Isolation and Identification of a Serotype 8b Avian Adenovirus from Laying Chicken

LU Xiao1，2， WU Jingqi1，3， ZHANG Fan4， HAN Yihang4， MU Jianqing5， LIANG Xian5， WANG Yun6，

CAO Bing7，YU Kexiang1， SONG Minxun1

（（1. Institute of Poultry， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan  250100， China;

2. College of Veterinary Medicine， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot  010018， China;

3. Shandong Agricultural University ， Taian  271018， China;

4. Yantai Aishijin Animal Health Products Co.， Ltd.， Yantai  264003， China;

5. Shandong Delino Bioengineering Co.， Ltd.， Zibo  256400， China;

6. Liaocheng Academy of Agricultural Sciences， Liaocheng  252000， China;

7.Tengzhou Animal Husbandry and Fisheries Development Centre， Tengzhou  275000， China）

Abstract：The diseased materials were collected from laying chicken with inclusion body hepatitis as the pathological feature in Weifang， Shandong Province. A virus strain was isolated from 7-day-old SPF chicken embryos，and identified as serum 8b avian adenovirus by PCR detection， sequencing analysis， evolutionary tree analysis and serum neutralization test. The virus was inoculated into 14-day-old SPF chickens by intramuscular injection.The results showed that only some of the experimental chickens had slight liver necrosis and degeneration， which was not consistent with the obvious liver necrosis or even rupture of the diseased chicken in clinical practice. This may be related to the feeding conditions， management level， chicken breeds and age， and drug use.

Keywords：Laying chicken Serotype 8b avian adenovirus;Inclusion body hepatitis;Isolation and identification