低氧胁迫对罗非鱼肠道微生物多样性的影响

陈坤海,覃惠明,刘忠诚,陈贵荣

(1.柳城县渔业技术推广站,广西 柳城 545200;2.柳城县动物疫病预防控制中心,广西 柳城 545200)

尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)原产于非洲,是世界性优良淡水养殖品种。罗非鱼具有生长快、抗逆性强、食性广等特点[1],其肉质紧实、口味鲜美、无肌间小刺、富含多种人体必需脂肪酸。罗非鱼自1958年引进中国以来,已成为广东、广西、海南等地的主要水产养殖对象[2]。

中国罗非鱼的养殖方式主要是集约化规模养殖[3],水体中的溶氧水平是养殖过程中的关键指标之一。水体中溶解氧(DO)浓度低于2 mg/L为低氧状态,鱼类长期处于低氧环境中,会导致其呼吸频率下降、摄食量减少、生长繁殖能力下降,甚至造成鱼类死亡[4]。为确保罗非鱼正常生长繁殖,通常利用增氧机或换水等方法将水体溶氧量控制在3～7 mg/L之间[5],但在极端恶劣天气或长途运输过程中会出现低氧情况。据文献报道,低氧胁迫明显抑制鲤(Cyprinuscarpio)的繁殖[6],促使瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrusvachelli)肠道组织的氧化应激和细胞凋亡[7],影响吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus)肝脏脂肪酸组成和部分血液生化指标,将缓慢影响罗非鱼的生长。低氧会为致病厌氧菌提供生长繁殖条件,加速其在肠道中的定殖,破坏肠道有益菌的多样性及丰富度,进而导致鱼肠道损伤及病变,增加致死风险[8]。但目前有关低氧胁迫对罗非鱼肠道微生物多样性的研究较少。本研究以罗非鱼肠道组织内容物为样本,研究低氧处理对罗非鱼肠道微生物菌群组成及菌群功能作用的影响,为探讨罗非鱼肠道微生物的影响因素及健康养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与设计

试验用尼罗罗非鱼购买于柳州市城中区水产养殖场,在广西科技大学水产养殖实验室鱼缸中进行循环水系统驯养2周。驯化期间,养殖用水(曝气24 h以上的除氯自来水),溶氧量:6.5～7.5 mg/L,pH值:7.3～7.9,水温保持在(28±1)℃。每日9:00和17:00投喂商业饲料(粗蛋白质28.0%、粗脂肪6.0%)。驯化结束后,随机选取36尾初体重为(20.00±0.1)g健康罗非鱼进行试验。共设定2个处理组:低氧组(DO:1.0～1.5 mg/L)和对照组(DO:6.5～7.5 mg/L),每组设置3个平行,每个平行6尾罗非鱼,分别放入6个鱼缸中,进行为期2周的养殖。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR扩增 按照DNA提取试剂盒(Omega Biotek,U.S.)说明书提取总DNA,用超微量分光光度计(SMA 6000,Merinton,Beijing)检测DNA浓度,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度。以338 F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806 R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)作为引物对16S rDNA基因V3～V4区域进行PCR扩增[11]。2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。AXyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收PCR产物。利用QuantiFiuorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)对PCR产物进行定量检测。

1.2.2 Illumina文库构建和测序 利用美吉生物云平台 (https://cloud.majorbio.com) 对数据进行生物信息统计分析。选择ASV分类学水平,Sobs指数类型,利用mothur-1.30分析软件制作稀释曲线图。采用Wilcoxon秩和检验分析α多样性指数组间差异显著性。利用R-3.3.1(Vegan)软件计算β多样性 Bray-Curtis距离矩阵,使用UPGMA算法构建样本等级聚类树,相同距离矩阵下进行主成分分析,比较不同样品细菌群落结构的相似性和差异程度。利用python-2.7分析软件,分析不同样品在门、属分类水平上的群落结构组成情况。利用Wilcoxon秩和检验方法进行双尾检验,在门、属水平上评估物种丰度差异的显著性水平,获取两组间具有显著性差异的物种信息。最后基于PICRUSt2功能预测、BugBase表型预测、FAPROTAX功能预测数据库,在门、属水平上进行不同样本菌群表型和功能预测。

2 结果与分析

2.1 多样性分析

通过分析α多样性评估低氧组和对照组中微生物群落的多样性和丰富度。由表1可知,低氧组和对照组微生物群落ace、chao、sobs及pd指数无显著性差异;低氧组微生物群落Shannon指数显著高于对照组;Simpson指数显著低于对照组测序覆盖率指数,且低氧组和对照组之间无显著性差异。

表1 罗非鱼肠道菌群α多样性分析

如图1所示(封三),在相同距离算法下,对所有样本进行ASV层级聚类分析,大体可分为2支,低氧组(Oxy_1—Oxy_6)聚为一支,对照组(Ctrl_1—Ctrl_6)聚为一支,表明低氧组与对照组的肠道微生物菌群之间存在显著性差异。

2.2 肠道菌群组成分析

通过韦恩图分析低氧组和对照组物种组成相似性及重叠情况。如图2A(封三)所示,在门分类水平上,低氧组和对照组共有的微生物菌群为12,低氧组特有的微生物菌群为0,对照组特有的微生物菌群为10;如图2B(封三)所示,在属分类水平上,低氧组和对照组共有的微生物菌群为85,低氧组特有的微生物菌群为43,对照组特有的微生物菌群为148;如图2C(封三)所示,在ASV分类水平上,低氧组和对照组共有的微生物菌群为150,低氧组特有的微生物菌群为164,对照组特有的微生物菌群为305。

2.3 肠道菌群差异分析

如图3A(封三)所示,通过门水平上的Wilcoxon秩和检验,低氧组中放线菌门(Actinobacteriota)显著低于对照组,Planctomycctota、梭杆菌门(Fusobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度显著高于对照组。如图3B(封三)所示,对主要菌属进行Wilcoxon秩和检验,低氧组代尔夫特菌属(Delftia)和Pseudorhodoplanes相对丰度显著低于对照组,Tundrisphaera、Methylobacterium-Methylorubrum、屈曲杆菌属(Ancylobacter)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、鲸杆菌属(Cetobacterium)、井杆菌属(Phreatobacter)显著高于对照组,军团杆菌属(Legionella)、罗姆布茨菌属(Romboutsia)显著高于对照组。

2.4 PICRUSt2功能预测

对低氧组和对照组罗非鱼肠道微生物菌群基因进行PICRUSt2功能预测。如图4(封三)所示,罗非鱼肠道微生物菌群功能基因主要参与次级代谢产物的生物合成、不同环境中的微生物代谢、ABC转运蛋白、双组分系统等相关通路。低氧胁迫整体降低了罗非鱼肠道菌群的代谢和生物合成,特别是氨基酸降解、脂肪酸代谢、氨基酸生物合成、碳代谢、氮代谢等,对罗非鱼肠道微生物菌群的能量代谢方面具有抑制作用。

3 结论

综上所述,低氧胁迫提高了罗非鱼肠道微生物菌群的多样性,降低放线菌门、代尔夫特菌属和根瘤菌属相对丰度,显著提高Methylobacterium-Methylorubrum致病菌相对丰度。低氧胁迫整体降低罗非鱼肠道菌群的代谢和生物合成,造成罗非鱼代谢紊乱,增加其患病的风险。