臭椿酮对非小细胞肺癌顺铂耐药细胞A549/DDP的增敏作用

李祥伶，刘承一，刘 镭，陈 龙，于胜利，许 倩*

（1.承德医学院基础医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院；3.承德市生态环境检验监测站）

肺癌是导致死亡最常见的恶性肿瘤之一[1,2]。据统计[3,4]，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在肺癌中患病率超过80%，且5年生存率仅为21%。目前，顺铂（cisplatin，DDP）仍是化疗一线用药，但长期使用会出现抗药性而导致治疗失败[5]。因此，寻找一种药物与之联用，增加药物敏感性，是肿瘤治疗研究中的热点。

中草药具有可利用性、有效性高且毒性相对较低的优势[6]。臭椿酮（ailanthone，AIL）是椿皮中提取的一种苦木苦味素类药物，早期研究多在抗菌、抗炎等方面，最近发现其在抗肿瘤方面也有显著作用，如前列腺癌、结直肠癌等[7-9]。AIL亦能逆转DDP、阿霉素等药物的耐药性[10]，但机制尚不明确，且在NSCLC的治疗中尚未见报道。因此，本文就AIL对A549/DDP细胞的增敏作用展开研究，为NSCLC中药辅助治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 仪器

美国BD公司FACS CaLibur型流式细胞仪；中国上海天能公司6100型化学发光仪；美国博腾公司ELX808TM型酶标仪；中国麦克奥迪公司AE2000型倒置光学显微镜；中国大龙兴创公司D3024R型台式高速冷冻离心机；中国海尔公司HR30-2A2型生物安全柜。

1.2 细胞及试剂

人肺癌细胞A549及人肺癌DDP耐药细胞（A549/DDP细胞）购于上海文生物科技有限公司；AIL（货号：SA9130)、MTT（货号：SA9130、M818C)、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；DDP（货号：HY-17394/CS-1122）购于美国MCE公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测和周期检测试剂盒（货号AP101、CCS012）购于杭州联科生物技术股份有限公司；PBS缓冲液（1×）、RPMI-1640 培养基及Trypsin-EDTA Solutio（n0.25%，1×）购于美国Gibco公司；胎牛血清购于以色列Biological Industries公司。

1.3 细胞培养

A549细胞和A549/DDP细胞用含有10%FBS的RPMI-1640 培养基，置于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。

1.4 MTT法检测细胞活力

将对数生长期的A549和A549/DDP细胞，胰酶消化，计数，以1×104个/孔接种于96孔板中，培养24h，分别按以下方案加药处理。方案一：A549细胞中加入梯度浓度（0、0.05、0.1、0.2、1、2、10、20、40μmol/L）AIL；方案二：A549/DDP细胞中加入梯度浓度（0、0.2、2、20、40、80、160、320μmol/L）AIL；方案三：为确定低毒性AIL浓度，在A549/DDP细胞中加入梯度浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2μmol/L）AIL；方案四：在A549/DDP细胞中加入梯度浓度（0、25、50、100、200、400、800μg/mL）DDP，并联合低浓度AIL。继续培养24h，加入MTT，孵育4h，加入100μL二甲基亚砜，震荡1～3min。用酶标仪在490nm波长处检测各孔OD值，计算细胞存活率。

1.5 药物联合作用的评价

利用CompuSyn软件中的Chou-Talalay中效分析法[11]，计算AIL与DDP联合用药的CI值，若CI＜1，认为两种药物有协同作用，CI=1认为两种药物有相加作用，CI＞1认为两种药物有拮抗作用[12,13]。

1.6 流式细胞术检测细胞周期

将对数生长期的A549/DDP细胞以1×106个/皿接种于培养皿中，培养24h，分空白组、DDP组（50μg/mL）、AIL组（0.6μmol/L）、AIL（0.6μmol/L）+DDP（50μg/mL）组用药，继续培养24h，收集各组细胞。根据试剂说明每组加入1mL DNA Staining solution和10μL Permeabilization solution，涡旋振荡10s混匀。室温避光孵育30min，低速上样，流式细胞仪进行检测。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

细胞培养及用药分组如1.6，收集各组细胞，根据试剂说明向每组加入100μL 1×Binding Buffer、5μL Annexin V-FITC 和10μL PI试剂混匀，室温避光孵育5min，流式细胞仪进行检测。

1.8 Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达

细胞培养及用药分组如1.6，加入RIPA细胞裂解液，提取总蛋白，12000r/min离心15～20min取上清，BCA法定量蛋白，取适量蛋白加入5×蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min变性，上样后行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2h，加入相应一抗（抗Bcl-2、Bax、Caspase-3等抗体均1:2000稀释，抗β-ACTIN抗体1:10000稀释），4℃过夜，次日用TBST清洗3次，加入二抗（山羊抗兔IgG以1：5000稀释）孵育1h，TBST清洗3次，凝胶成像系统显影，拍照，ImageJ软件分析条带灰度值，计算目的蛋白的相对表达水平。

1.9 统计学方法

采用SPSS 25.0软件统计分析，数据以均值±标准差（）表示，采用单因素方差分析进行3组或3组以上的差异比较，采用Bonferroni进行组间两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AIL对A549及A549/DDP细胞活力的影响

MTT实验结果发现，用不同浓度AIL作用A549细胞，当药物浓度≥0.05μmol/L时，细胞活力明显下降（图1A，P＜0.05）；而用不同浓度AIL作用A549/DDP细胞后，0.2μmol/L浓度对细胞活力无明显影响（图1B，P＞0.05），药物浓度≥2μmol/L时，细胞活力显著下降（图1B，P＜0.05）。为选择AIL作用的低毒性，用低梯度浓度AIL作用A549/DDP后，发现0.6μmol/L为具有统计学意义的最低浓度（图1C，P＜0.05），可作为下一步实验的用药浓度。

图1 AIL对A549、A549/DDP细胞活力的影响

2.2 AIL与DDP联合用药的协同作用

采用CompuSyn软件计算AIL与DDP联合用药的CI值，如表1所示。当DDP浓度≥50μg/mL时，CI＜1，说明联合用药有协同作用。当DDP浓度为50μg/mL，与0.6μmol/L AIL联合应用时，A549/DDP细胞的抑制率为37.18±1.90%，CI值为0.72±0.09%。因此，为了减少药物不良反应，选择药物浓度小且具有联合作用的50μg/mL浓度的DDP进行后续实验。

表1 0.6μmol/L AIL与不同浓度DDP联合作用A549/DDP细胞的联合用药指数

2.3 AIL对A549/DDP细胞周期的影响

流式细胞术检测AIL对A549/DDP细胞周期的影响，如图2。与空白组比较，AIL+DDP组、AIL组细胞在G1期明显阻滞，与DDP组比较，AIL组细胞在G1期阻滞增加（图2B，P＜0.05）；且分别与空白组、DDP组、AIL组相比，AIL+DDP组细胞在G2期明显阻滞（图2C，P＜0.05）；各组细胞S期无明显改变（图2D，P＞0.05）。

图2 用药后各组A549/DDP细胞细胞周期变化情况

2.4 AIL对A549/DDP细胞凋亡的影响

流式细胞术检测细胞凋亡情况，如图3。结果显示，空白组、DDP组、AIL组和AIL+DDP组的凋亡率分别是10.46±0.52%、36.03±0.63%、16.51±0.96%和40.44±0.79%（图3A）。与空白组、DDP组和AIL组比较，AIL+DDP组细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义（图3B，P＜0.05）。

图3 用药后各组A549/DDP细胞凋亡率

2.5 AIL对A549/DDP细胞凋亡及周期相关蛋白的影响。

AIL作用于A549/DDP细胞后，Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase3、CDK4、CyclinD1的蛋白表达水平，如图4所示。分别与空白组、DDP组和AIL组比较，AIL+DDP组中Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平均明显下降，AIL组比空白组Caspase-3、Bcl-2表达水平显著下调（图4E、F，P＜0.05）。AIL+DDP组与空白组、DDP组、AIL组比较，AIL+DDP组中Cleaved Caspase3、Bax的表达水平明显升高；AIL组比空白组的Cleaved Caspase3、Bax表达水平显著增加（图4B、C，P＜0.05）。与空白组、DDP组比较，AIL+DDP组中CDK4、CyclinD1的表达水平上升；AIL组与空白组、DDP组相比，AIL组CDK4、CyclinD1的蛋白表达水平明显上升（图4D、G，P＜0.05）。

图4 用药后各组A549/DDP细胞中蛋白表达水平

3 讨论

DDP化疗是晚期NSCLC以及手术切除后降低复发风险的重要治疗手段[14]。然而，DDP的持续使用会造成患者产生抗药性，从而导致NSCLC治疗失败[6]。研究[15]表明，有多种机制参与了顺铂耐药，包括顺铂在细胞内积累减少、外排增加、DNA修复能力增强、修复途径增加以及凋亡受抑制等。因此，寻找一种低毒高效的药物，增加DDP敏感性，降低化疗用药量，是目前NSCLC治疗中一个非常重要的策略。

中药单体作为我国独特的治疗手段，因其低毒高效成为目前抗肿瘤辅助药物开发的重点[16]。AIL即为中草药椿皮中提取的小分子化合物。本研究发现，AIL作用A549细胞后，当物浓度≥0.05μmol/L时，细胞活力明显下降；作用A549/DDP细胞后，药物浓度≥2μmol/L时，细胞活力显著下降，这表明AIL对A549、A549/DDP细胞的增殖具有明显抑制作用，这与田艳等[17]研究一致。

细胞凋亡是维持生物体和细胞内稳态的一个重要生物学过程。Caspase-3是参与凋亡的主要途径之一[18,19]。在对乳腺癌的研究[20]中发现，AIL具有诱导细胞凋亡，并将细胞周期阻滞细胞在G1期。本研究进一步检测AIL作用后A549/DDP细胞周期和凋亡情况，结果亦提示AIL作用A549/DDP细胞后，细胞在G1期阻滞，而AIL与DDP联合作用后，细胞在G1期和G2期都发生了明显的阻滞，且周期相关蛋白CDK4、CyclinD1蛋白的表达水平显著升高，AIL可以抑制A549/DDP细胞增殖。本研究检测亦发现，细胞总凋亡率从单独使用DDP的（36.03±0.63）%上升到联合应用后的（40.44±0.79）%，同时检测凋亡相关蛋白的表达情况。AIL用药后，Caspase-3表达水平显著下降，Cleaved Caspase3表达水平明显升高，进一步说明AIL增加A549/DDP细胞对DDP的敏感性可能通过Caspase3介导的凋亡途径。

另外，Bcl-2和Bax都是Bcl-2家族的同源蛋白，有研究[21,22]指出Bcl-2相关蛋白的表达与顺铂耐药联系密切。本研究结果显示，AIL与DDP联合作用A549/DDP细胞后，Bcl-2的蛋白表达水平明显下调，而Bax蛋白表达水平显著上升。

综上所述，AIL能抑制A549/DDP细胞的增殖，诱导其凋亡，增强DDP对A549/DDP的敏感性，抑制A549/DDP细胞生长并促进其凋亡。但是，AIL能否逆转肺癌DDP耐药尚不可知，其机制也有待研究。