规模化种猪场猪流行性腹泻监测及防控

何贵府,柏家果,余科辰,陆颖,黄伟坚,韦祖樟,陈樱,欧阳康*

(1.广西大学动物科学技术学院广西高校动物疫病预防与控制重点实验室,广西 南宁 530005;2.广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心,广西 南宁 530005; 3.广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室,广西 南宁 530005)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种急性、高度接触性肠道传染病[1]。各个阶段、不同品系的猪群均易感染PEDV[2],严重危害1～10日龄的仔猪[3],主要临床症状为水样腹泻、呕吐、食欲不振、脱水甚至死亡[4,5]。自家组织灭活苗和反饲是防控PED常用手段[6],这两种方法对本场疾病更具有针对性。自家组织灭活苗安全性较好,但病料组织在灭活过程中病毒的免疫原性容易受到影响,从而导致免疫效果不明显,需要大剂量或添加佐剂来增强机体免疫应答[7]。反饲是将猪场发病仔猪新鲜肠道组织及其内容物,以口服的方式免疫母猪群,哺乳仔猪则可以通过被动免疫的方式,吸食初乳获得更高滴度的母源抗体。与自家组织灭活苗相比,反饲免疫效果更好,免疫期持续时间更长,缺点是安全性较低[8]。

本实验旨在通过对本案例的论述与分析总结,提高生猪养殖企业对PED的认识,并为PED的防控提供理论依据和技术支持。

1 材料和方法

1.1 猪场背景信息及免疫程序

广西某规模化种猪场存栏PIC品系经产母猪1600头左右,月平均断奶仔猪2600头左右,保育猪和育肥猪各存栏3500头左右。PED免疫程序:2021年,怀孕母猪产前10d,肌内注射自家组织灭活苗4mL/头,后备母猪入经产母猪群前肌内注射自家组织灭活苗4mL/头。2022年,怀孕母猪产前30d和10d,肌内注射自家组织灭活苗4mL/头,并对180日龄左右的后备母猪进行反饲和入经产母猪群前免疫自家组织灭活苗4mL/头。

1.2 产房仔猪死亡率数据的收集

由养殖场内生产人员负责统计,场内统计员汇总。

1.3 PED病原检测样品和全血样品的采集和处理

PED病原检测样品包括腹泻粪便样品和环境样品,样品加入一定量的生理盐水,10000r/min离心2min后取上清液。全血样品的采集和处理,保育和育肥阶段猪只血液采集自前腔静脉,母猪血液采集自耳缘静脉,4～8h内分离并收集血清。以上样品均置于-20℃保存备用。

1.4 病原检测

使用磁珠法核酸提取试剂盒(购自广州美基生物有限公司)提取样品核酸,再使用PEDV荧光PCR试剂盒(购自厦门普康同创生物科技公司)进行PED抗原检测。将试剂盒冻干粉以180μL冻干回溶液回溶并充分震荡混匀,取上述溶液20μL加入样品核酸5μL和阴性、阳性对照,进行RT-qPCR扩增。结果判定:腹泻粪便样品中,Ct值≤37,样本判定为阳性;无Ct值,样本判定为阴性;37

1.5 IgG抗体检测

使用PED IgG ELISA检测试剂盒(湖南农业大学提供)对血清样品进行检测,抗原板加入1∶80稀释的血清120μL,37℃孵育30min,250μL洗涤液洗涤3次;加入100μL酶标记物,37℃孵育30min,250μL洗涤液洗涤3次;加入底物TMB 50μL,37℃避光显色15min;加入50μL终止液终止显色。混匀,在450nm波长下读取OD值。结果判定:阳性对照OD450 nm值≥0.55,阴性对照OD450 nm值<0.10,实验成立。

1.6 数据分析

数据用Excel 2019软件进行初步统计和整理,用GraphPad prism 8进行作图和统计分析,利用Ordinary one-way AVOVA进行差异显著性检验。

2 结果

2.1 产房仔猪死亡率

产房仔猪死亡率结果显示(图1),2021年10月和12月产房仔猪死亡率较高,分别达到25.33%和20.79%,其中10月的高死亡率是由于猪价下行猪场进行控栏,主动对仔猪进行安乐死所致,而12月的仔猪高死亡率则是由于暴发了PED。据统计,PED暴发期间,猪场腹泻最严重的栋舍产仔数为416头,仔猪死亡数为298头,死亡率高达71.63%(图示未给出)。2021年5月、6月和11月,产房仔猪死亡率较低,分别为6.58%、6.63%和6.78%,2022年产房仔猪死亡率稳定在10.5%左右。

图1 2021年4月—2022年6月广西某猪场产房仔猪死亡率和猪价统计

2.2 PED病原检测

使用RT-qPCR对腹泻粪便样品和环境样品进行PED病原检测,获得的数据用Excel 2019软件进行统计和整理。结果显示(表1),整体上看,从2021年第三季度到2022年第二季度,总共检测数量为1083份,阳性率为19.21%,Ct值均值为31.25。从时间上看,2021年第三季度到2022年第二季度的PEDV阳性率分别为33.09%、17.06%、31.49%和2.46%。从样品来源上看,PEDV阳性率从高至低排列是保育猪、环境样品、哺乳仔猪和育肥猪,分别为39.82%、24.47%、18.63%和11.17%。值得注意的是,从2021年第三季度到2022年第二季度,哺乳仔猪腹泻样品的PEDV检出率分别为50.43%、15.22%、11.76%和0,呈下降趋势。

表1 广西某规模化种猪场腹泻和环境样品的PED RT-qPCR病原检测结果

2.3 PED IgG抗体检测

使用试剂盒对不同阶段猪只血清样品进行PED抗体检测,结果显示(图2),怀孕母猪的PED抗体OD值高于保育猪和育肥猪,其中,怀孕母猪2021年第三季度抗体水平显著高于其他3个季度(P<0.05),2021年第四季度抗体水平最低,且显著低于2021年第三季度和2022年第一季度(P<0.05)。保育猪2021年第四季度抗体水平最低,显著低于2021年第二季度和2021年第三季度(P<0.05),与怀孕母猪的趋势相似。育肥猪在试验期间抗体水平差异不显著(P>0.05)。

注:柱状图内数字为样品数量,2022年第一季度由于场内防控PEDV的要求,未对保育猪进行采样,此季度无数据。* :P<0.05;***:P<0.01。

3 讨论

PED的流行一般有明显的季节性,常在寒冷季节暴发[9],在其他季节则以零星、散发为特征。广西地区全年温度较高,猪场更注重防暑降温,防寒保暖的措施不够完善,冷应激会使猪群免疫应答能力下降。另外,由于母猪胎盘结构特殊,母源抗体不能直接通过胎盘传递给仔猪,仔猪只能通过摄入初乳来获得母源抗体,冷应激时,新生仔猪的初乳摄入量明显降低[10],获得的母源抗体不能给仔猪提供良好保护。本研究猪场在2021年第四季度的Ct值均值最低,排毒量较大,且猪群在第四季度PED IgG抗体水平最低,这些成为导致猪场PED暴发的主要原因之一。

PEDV主要通过粪口传播[4],对哺乳仔猪危害最为严重,病死率高达80%～100%[11]。本研究猪场在2021年12月PED暴发期间,全场产房仔猪死亡率为20.79%。主要原因是,场内第一时间采取了一系列防控措施,如暴发PED的栋舍专人饲养管理、发病仔猪及时安乐死并无害化处理、向水样腹泻物铺洒干燥粉阻止PEDV通过气溶胶传播[12]、禁止冲洗粪便防止PEDV通过下水道传播等。养殖场应根据场内自身的条件制定严格的生物安全管理制度来控制PEDV的传播,有效的内部生物安全制度能够切断PEDV在猪场内的传播[13]。

沙万里等[14]发现自家组织灭活苗抗体平均水平高于商品疫苗,说明自家组织灭活苗对PED的防控有一定的效果。本研究中,对猪场自家组织灭活苗使用的病料组织进行了RT-qPCR检测,发现不同批次间的自家组织灭活苗病料组织的病毒含量差异大,推测这可能是本场自家组织灭活苗免疫效果不稳定的原因之一。关于反饲,2022年对后备母猪进行反饲驯化后,怀孕母猪群的PED IgG 抗体水平比2021年第四季度出现了明显上升,而且对后备母猪反饲驯化后,产房仔猪的死亡率在2022年1月出现了明显降低。李孝文等[15]研究发现,后备母猪经过PEDV驯化的猪场PED发病频率、发病损失都相对较低,各项生产指标相对更加优良,这与本次的研究结果一致。

近年来,PED在我国的流行日趋严重,仔猪的高死亡率给生猪养殖业带来严重的经济损失。本研究发现,通过建立完善的生物安全防控体系、对母猪群免疫自家组织灭活苗以及对后备母猪进行反饲驯化,可以有效控制PED疫情的暴发和蔓延,具有重要的参考意义。